通过对基因编码表面粘附结构的光学刺激, 证明了在任意空间模式下以高分辨率沉积大肠杆菌细菌生物膜的方法。
空间结构和图案在细菌生物膜中起着重要的作用。在这里, 我们演示了一种可访问的方法, 将大肠杆菌生物膜培养成任意空间模式的高空间分辨率。该技术使用基因编码的光遗传学 construct—pDawn-Ag43—that 夫妇生物膜形成在大肠杆菌中蓝光的光刺激。我们详细介绍了用 pDawn-Ag43 转化大肠杆菌的过程, 准备所需的光学设置, 以及使用 pDawn-Ag43 细菌培养图案生物膜的协议。使用此协议, 空间分辨率低于25微米的生物膜可以在不同的表面和环境 (包括封闭腔室) 上进行图案化, 无需加工、洁净室设施或表面预处理。该技术适用于研究生物膜结构效果的应用, 对生物膜模式提供可调谐控制。更广泛地说, 它在生物材料、教育和生物艺术方面也有潜在的应用。
生物膜是微生物的表面附着群落, 以其强大的结构-功能耦合而闻名。生物膜的空间几何和图案在整体群落功能中发挥着重要作用 (反之亦然)1。生物膜结构中涉及的小长度尺度–以2微米的顺序–使生物膜模式的可调谐和方便控制成为一个具有挑战性的问题。在这里, 我们演示了一个协议, 允许生物膜精确地在任意几何形状, 基于光照明。
这里提出的协议使用 pDawn-Ag433, 一种光遗传学的结构, 夫妻生物膜形成在大肠杆菌细菌到光照明通过驱动 Ag43 的表达 (黏附基因负责表面黏附和生物膜pDawn4 (由光学照明控制的转录调节器) 的控制下形成。该方法使用方便, 可在各种表面环境 (包括封闭 (透明) 培养室) 中进行生物膜的图案化。与现有的细胞沉积方法相比, 如液滴沉积5或表面 prepatterning/处理6, pDawn-Ag43 不需要微细加工或洁净室设施, 不需要材料超出那些可供典型微生物学实验室使用。它能够以低于25微米的空间分辨率进行模式, 接近自然存在的生物膜2中独立王国的空间尺寸。总的来说, 这项技术提供了操作生物膜结构的能力, 然后开辟了许多途径来研究细菌群落中的微生态学7。此外, 图案生物膜可以提供一个方便的平台, 以设计有用的生物材料8,9。在本文中, 我们讨论了使用 pDawn-Ag43 进行阵列生物膜所需的基本协议, 并解决了与该方法相关的潜在修改和故障排除问题。
鉴于需要的研究工具, 允许生物膜结构控制, 我们提出了一个易于使用的协议, 使用 pDawn-Ag43 光遗传学构造模式细菌生物膜。利用这种技术,大肠杆菌生物膜可以在各种表面环境 (包括封闭腔室) 上进行光学图案处理, 空间分辨率低于25微米。
总的来说, 本协议可分为四个主要部分: (1) 制备 pDawn-Ag43 菌, (2) 制备光学和培养装置的硬件, (3) 预光照细菌生长步骤, 以及 (4) 后光照冲洗和成像。
1节的关键部分是成功地将 pDawn-Ag43 质粒转化为感兴趣的大肠杆菌菌株。这是通过分离高质量纯化质粒和生成高质量的合格细胞进行转化 (表 1, 故障排除) 来促进的。
2节的关键部分是投影机设置的优化, 使照明强度调整到50微瓦/厘米2在 460 nm 波长, 和投影机正确地聚焦在生物膜样品高度。请注意, 在本协议中, 我们描述了一个倒置照明设置, 投影机从下面照射光线, 向上朝向生物膜样本。这种设置的优点是, 光只有在到达生物膜形成表面之前, 才需要穿过培养皿的底部。上面的照明意味着光必须穿过生物膜表面上方的液体介质, 在生长过程中, 它会与浮游细胞一起多云。除了这些关注之外, 在光学设置中尽量减少杂散光也很重要, 例如, 通过在孵化器内部覆盖反光表面, 这有助于获得更清晰的图案生物膜。在相关说明中, 还可以通过使用光掩模来控制光照模式 (图 3D、图 4C) 来获得更清晰的生物膜模式。需要故障排除的常见问题包括在较高温度下的投影机可靠性问题 (例如37 °c), 通过在较低温度 (例如30 摄氏度) 孵育生物膜生长, 以及计算机软件, 可将其降至最低。在隔夜增长期间导致操作系统更新或蓝光过滤 (表 1)。还需要注意的是, 根据使用的投影机和孵化器型号, 投影机产生的热量也可能会导致室内温度高于孵化器设定温度, 这可能需加以纠正。
3节的关键部分是获得可靠和可重复的细菌样本, 然后才被光照诱导。因此, 建议通过在琼脂板上将它们 pDawn-Ag43, 然后使用液体培养步骤, 以确保细菌在晚期指数生长阶段以可重复的速度照射/诱导, 从而获得克隆菌落。方式。
最后, 4 节的关键部分是彻底, 但也轻轻地, 洗去浮游细胞残留在生物膜模式协议之后;因此, 建议使用 PBS 执行多个温和的冲洗步骤。
与现有的细胞模式5,6的技术相比, 基于 pDawn-Ag43 的光学生物膜图案具有合理的低进入门槛, 因为它不需要微细加工、洁净室设施、复杂化学, 或表面预处理, 但仍然能够与高分辨率 (25 微米) 的模式, 通常与微细加工技术相关联。该方法扩展了以往细菌光刻技术控制基因表达17的工作。目前, pDawn-Ag43 质粒仅限于大肠杆菌, 因为它使用基于临市局的复制来源, 但 pDawn 和 Ag43 在其他 (革兰氏阴性) 细菌物种中都是相容的。遗传技术可用于潜在地引入不同细菌物种的光调节生物膜形成, 并代表未来研究的一个可能方向。该技术的另一个潜在限制是, 它的工作原理是增加生物膜形成在弱原生生物膜形成的菌株 (例如, MG1655大肠杆菌)。然而, 具有强原生生物膜形成的菌株具有生物膜形式, 无论光照条件如何, 使用 pDawn-Ag43 排除图案生物膜形成;然而, 光遗传学技术可能仍然适用于调节生物膜的形成。我们注意到, 在其他情况下, 可以使用替代的生物膜模式方法, 例如通过光学 c-二-GMP 调制18。
总体而言, 基于 pDawn-Ag43 的模式将适用于研究生物膜结构对功能1的影响的应用, 因此, 可以从可调谐控制生物膜模式中获益–特别相关其中突出的例子是生物膜中微生物生态学的研究2。未来的方向包括制作图案生物材料8、9和/或结构化细菌群落。这种可访问的协议的替代应用还包括生物艺术19, 考虑到明确的美学潜力, 以及正规和非正规生命科学教育 20,21,22。从教育的角度来看, 这里描述的协议结合了许多相关技术 (细菌培养, 转化, 光学/光遗传学), 也模块化可扩展 (例如, 包括微流体)。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢 d 玻璃, h. Cira, a. 乔科斯, s. 瑞吉, 和 b. 他们的有用建议和施波尔曼实验室, 以获得他们的共聚焦显微镜的关键。此外, 作者还承认斯坦福生物 X 宝和 NSERC PGS 研究金、国家卫生研究院 (R21-AI-139941) 和美国癌症协会 (RSG-14-177-01) 的支持。
DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid – plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center – Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria – if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector – many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed – one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity – many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) – UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter – place above projector aperture |
Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |