Vi visar en metod för insättning Escherichia coli bakteriell biofilm i godtyckliga rumsliga mönster med hög upplösning använder optisk stimulering av en genetiskt kodade yta friktion konstruktion.
Rumslig struktur och mallning spela en viktig roll i bakteriell biofilm. Här visar vi en tillgänglig metod för odling av E. coli biofilmer i godtyckliga rumsliga mönster med hög rumslig upplösning. Tekniken använder en genetiskt kodade optogenetic konstruktion — Misterrayban1-Ag43 — som par biofilm bildning i E. coli att optiska stimulering av blått ljus. Vi detalj processen för att omvandla E. coli med Misterrayban1-Ag43, förbereda krävs optiska set-up och protokollet för odling mönstrade biofilmer med Misterrayban1-Ag43 bakterier. Användning av detta protokoll, kan biofilmer med en rumslig upplösning nedan 25 μm vara mönstrade på olika ytor och miljöer, inklusive slutna kamrar, utan att kräva mikrofabrikation, renrum faciliteter eller ytans förbehandling. Tekniken är bekvämt och lämpligt för användning i applikationer som undersöker effekten av biofilm struktur, som tillhandahåller avstämbara kontroll över biofilm mallning. Mer allmänt, den har också potentiella tillämpningar inom biomaterial, utbildning och bio-art.
Biofilmer är ytan-anslutna samhällen av mikrober, och är kända för sin starka struktur och funktion-koppling. Rumslig geometri och mallning av biofilmer spela en viktig roll i gemenskapens Totalfunktion (och vice versa)1. De små längden skalor inblandade i biofilm struktur — storleksordningen tiotals µm2— göra avstämbara och bekväm kontroll av biofilm mönstring ett utmanande problem. Här visar vi ett protokoll som möjliggör biofilmer vara just mönstrade i godtyckliga geometrier, baserat på optisk belysning.
Det protokoll som presenteras här använder Misterrayban1-Ag433, en optogenetic konstruktion som par biofilm bildning i E. coli -bakterier till optisk belysning av körning uttrycket av Ag43 (ett adhesin gen som ansvarar för surface vidhäftning och biofilm bildande) under kontroll av Misterrayban14 (en transkriptionell reglering kontrolleras av optisk belysning). Metoden är praktiskt att använda och kan ytan mönster biofilmer på olika miljöer, inklusive bifogade (transparent) kultur chambers. Jämfört med befintliga cell nedfall metoder, såsom droplet-baserade nedfall5 eller yta prepatterning behandlingsrum6, Misterrayban1-Ag43 kräver inte mikrofabrikation eller renrum faciliteter och kräver inte material utöver de tillgängliga för en typisk mikrobiologiska laboratoriet. Det ska kunna mönster med en rumslig upplösning nedan 25 μm, närmar sig microcolonies i naturligt befintliga rumsliga dimensioner biofilmer2. Sammantaget ger denna teknik förmågan att manipulera biofilm struktur som sedan öppnar många vägar för att studera microecology i bakteriesamhällen7. Mönstrad biofilmer kan dessutom ge en bekväm plattform som ingenjör användbar biomaterial8,9. I detta papper, vi diskutera grundläggande protokollet krävs för mönstring biofilmer med Misterrayban1-Ag43 och åtgärda potentiella ändringar och felsökning relaterade till metoden.
Mot bakgrund av behovet av forskningsverktyg som möjliggör en biofilm struktur kontroll, har vi presenterat en lätt-till-använda protokoll för mönstring bakteriell biofilm med den Misterrayban1-Ag43 optogenetic konstruktion. Med denna teknik, kan E. coli biofilmer vara optiskt mönstrade på olika surface miljöer, inklusive sluten kammare, med en rumslig upplösning nedan 25 μm.
Övergripande, detta protokoll kan delas upp i fyra huvudavsnitt: (1) utarbetandet av Misterrayban1-Ag43 bakterier, (2) utarbetandet av den optiska och kultur set-up maskinvara, (3) stegen före belysning bakterietillväxt och (4) efter belysning sköljningar och imaging.
Den kritiska delen av avsnitt 1 är framgångsrika omvandlingen av Misterrayban1-Ag43 plasmid i E. coli stam av intresse. Detta underlättas av isolera högkvalitativ renad plasmid och generera hög kvalitet behöriga celler för omvandling (tabell 1, felsökning).
Den kritiska delen av avsnitt 2 är optimering av projektorn upplägget så att belysning intensitet justeras till 50 μW/cm2 på 460-nm våglängd och projektorn är korrekt inriktad på biofilm prov höjden. Observera att i detta protokoll, beskriver vi en inverterad belysning set-up som där projektorn lyser ljus underifrån, uppåt mot biofilm provet. Fördelen med detta upplägg är att ljuset bara behöver resa genom botten av kultur skålen innan den når biofilm bildning ytan. Belysning ovanifrån innebär att ljuset måste färdas genom flytande media över biofilm ytan, som, under tillväxten, blir grumlig med plankton celler. Förutom dessa farhågor, är det också viktigt att minimera ströljus i optiska set-up som möjligt, exempelvis genom att täcka upp reflekterande ytor på insidan av inkubatorn — detta hjälper till att få skarpare mönstrade biofilmer. I en liknande anteckning, kan skarpare biofilm mönster också erhållas med hjälp av en photomasken för att styra belysning mönster (figur 3D, figur 4 c). Vanliga problem som kräver felsökning omfatta projektorn tillförlitlighetsproblem vid högre temperaturer (t.ex., 37 ° C), som kan minimeras genom ruvning biofilm tillväxten vid lägre temperaturer (t.ex., 30 ° C), samt datorprogram som orsakar uppdateringar av operativsystemet eller blått ljus filtrering under natten tillväxt (tabell 1). Det är också viktigt att notera att, beroende på projektorn och inkubatorn modell används, det är också möjligt att värme som alstras från projektorn kommer att resultera i en högre invändig temperatur än inkubatorn inställd temperatur, som kan behöva korrigeras.
Den kritiska delen av avsnitt 3 är att erhålla pålitliga och repeterbara bakteriell prover innan de induceras av belysning. Av denna anledning rekommenderas att erhålla klonal kolonier av Misterrayban1-Ag43 bakterier genom strimmor ut dem på en agarplatta och sedan använda flytande kultur stegen så att bakterierna är upplyst/inducerad på sena exponentiella tillväxtfasen i en repeterbar sätt.
Slutligen, den kritiska delen av avsnitt 4 är att grundligt, men också försiktigt, tvätta bort de plankton cellerna som återstår efter den biofilm som mönstring av protokollet. Således, det rekommenderas att utföra flera steg i milda skölj med PBS.
Jämfört med befintliga tekniker för cell mönster5,har6, optisk biofilm mönstring utifrån Misterrayban1-Ag43 en rimligt låg barriär av posten att använda, eftersom det inte kräver mikrofabrikation, renrum faciliteter, komplex kemi, eller ytans förbehandling, ännu är fortfarande kunna mönster med hög upplösning (25 μm) vanligtvis förknippas med mikrofabrikation tekniker. Metoden omfattar tidigare arbete på bakteriell photolithography för att styra gen uttryck17. För närvarande är Misterrayban1-Ag43 plasmid begränsad till E. coli, som den använder en pUC-baserade ursprunget för replikering, men Misterrayban1 och Ag43 är båda kompatibla i andra (gramnegativa) bakteriearter. Genetiska tekniker finns tillgängliga för att eventuellt införa ljus-reglerade biofilm bildning till olika bakteriearter och representerar en möjlig riktning för framtida forskning. En annan potentiell begränsning av tekniken är att det fungerar genom att öka biofilm bildning i stammar med svag infödda biofilm bildning (t.ex., MG1655 E. coli). Stammar med starka inhemska biofilm bildning har dock biofilmer form oavsett belysning villkor, utgör hinder för mönstrade biofilm bildning med Misterrayban1-Ag43 som beskrivs här; optogenetic tekniker kan ändå fortfarande bevisa tillämpliga reglera biofilm bildning. Vi noterar att alternativa metoder för biofilm mönstring i andra sammanhang, kan vara tillgängliga, till exempel via optisk c-di-GMP modulering18.
Sammantaget Misterrayban1-Ag43 baserat mönster kommer att vara lämpliga för användning i applikationer som undersöka effekten av biofilm struktur på funktion1 , och därför kunde dra nytta avstämbara kontroll över biofilm mallning — en särskilt relevant exempel för att belysa är studiet av mikrobiell ekologi i biofilmer2. Framtida inriktningar inkluderar att göra mönstrade biomaterial8,9 eller strukturerad bakteriesamhällen. Alternativa tillämpningar av detta tillgängligt protokoll inkluderar även bio-art19, med tanke på den tydliga estetiska potential, samt formella och informella life science utbildning20,21,22. Ur ett pedagogiskt perspektiv, protokollet beskrivs här kombinerar många relevanta tekniker (bakterieodling, transformation, optik/optogenetik) och är också modulärt utdragbara (t.ex., inkluderar mikrofluidik).
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar D. glas, H. Kim, N. Cira, A. Choksi, S. Rajan och B. nycklar för deras användbara förslag och Spormann lab för tillgång till deras confocal mikroskopet. Dessutom erkänner författarna stöd från Stanford Bio-X Bowes och NSERC PGS stipendier, National Institute of Health (R21-AI-139941), och American Cancer Society (RSG-14-177-01).
DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid – plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center – Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria – if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector – many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed – one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity – many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) – UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter – place above projector aperture |
Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |