מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית
Summary
טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.
Abstract
חזון חדות גבוהה היא תהליך בכבדות הצורכים אנרגיה, הרשתית פיתחה מספר עיבודים ייחודיים לדרישות בדיוק כזה תוך שמירה על שקיפות של הציר חזותי. לפליטת כדי איזון עדין זה לגרום מחלות מסנוור, כגון רטינופתיה סוכרתית. לכן, ההבנה של האנרגיה חילוף החומרים משתנה ברשתית במהלך המחלה הכרחי להתפתחות של טיפולים רציונלי עבור גורמים שונים של אובדן vison. הופעתו האחרונה של מנתחי השטף חוץ-תאית זמין מסחרית הפך המחקר של חילוף החומרים האנרגיה ברשתית נגיש יותר. פרוטוקול זה מתאר את השימוש כזה מנתח כדי למדוד את התרומות לאספקת אנרגיה ברשתית באמצעות זרועותיה עיקרון שני – זרחון חמצוני, גליקוליזה – מאת לכימות שינויים בשערי צריכת חמצן (OCR), חוץ-תאית המחירים acidification (ECAR) כאל שליחים עבור המסלולים הללו. טכניקה זו מבוצעת בקלות ברקמת הרשתית explanted, הקלה על הערכה של התגובות מרובות סוכנים תרופתי בניסוי יחיד. חתימות מטבולית הרשתיות מחיות חסר רוד קולט אור איתות מושווים לפקדים פראי-סוג בשיטה זו. מגבלה משמעותית בטכניקה זו הוא חוסר היכולת להבחין בין ניצול האנרגיה הותאם-אור, dark-adapted, שיקול חשוב הפיזיולוגיות ברקמת הרשתית.
Introduction
הרשתית היא בין הרקמות ביותר דורש אנרגיה מערכת העצבים המרכזית1. כמו רוב רקמות, שהיא מייצרת אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך גליקוליזה ב זרחון חמצוני ציטוזול או דרך בתוך המיטוכונדריה. היתרון האנרגטי של זרחון חמצוני על גליקוליזה לייצר ATP ממולקולה אחת של גלוקוז נקי: 36 מולקולות של ATP שנוצר מתוך לשעבר לעומת 2 מולקולות של ATP שנוצר האחרון. בהתאם לכך, הנוירונים ברשתית תלויים בעיקר נשימה מיטוכונדריאלי לאספקת אנרגיה, זה משתקף על ידי שלהם צפיפות גבוהה של המיטוכונדריה2. ובכל זאת, הרשתית גם מסתמכת במידה רבה על מכונות glycolytic גם כאשר חמצן בשפע. תהליך זה של אירובי גליקוליזה תוארה לראשונה על ידי אוטו ורבורג3, מי פעם ציין, כי הרשתית הרקמה רק שלאחר mitotic מסוגל צורה זו של חילוף החומרים4בתאים סרטניים. מאז תצפיות ראשוניות אלה, ברקמות רבות שלאחר mitotic תוארו לעסוק בדרגות שונות של גליקוליזה בנוסף זרחון חמצוני כדי לענות על דרישותיהם ATP.
Phototransduction, פיגמנט חזותי מיחזור, ביוסינטזה של מקטעי החיצוני קולט אור, בפעילות הסינפטית הם כל התהליכים תובעניים אנרגיה photoreceptors, מחלקת המשנה השולט עצביים ברשתית. אך הצורך להעביר באופן פעיל יונים נגד שלהם חשמל ומעברי הריכוז הוא עד כה התהליך לארוך ביותר אנרגטית נוירונים1. Photoreceptors הם נוירונים מוזר במובן שהם אינם depolarized בהיעדר גירוי (קרי, בחושך), ואילו גירוי אור מפעילה ערוץ הסגר, hyperpolarization הבאים. לכן, בחושך, הרשתית צורכת כמויות גדולות של ATP כדי לשמור על דפולריזציה או “זרם אפל” שלה, כפי שהיא מכונה בדרך כלל. מההיבט אדפטיבית, הוא אתגר גדול באספקת אלה כמויות אדירות של ATP עבור אורגניזמים לשמור על בהירות חזותית באמצעות לציר האופטי. הארכיטקטורה ברשתית הפוך אצל יצורים מודרני הוא הפתרון דומיננטי, כמו זה שומרת את הרשת נימי צפופה הספקת photoreceptors לברוח מדרכו של אור. . אבל זה מעורר פליאה bioengineering טבעי מקומות הרשתית צוק במונחים של שמורת מטבולית. עלבונות קטן אפילו לרשתית פוטנציאלי יכול לשבש את האיזון העדין של אספקת אנרגיה לדרוש, תפקוד חזותי או עיוורון פרנק עשוי לנבוע במהירות.
בהתחשב הדרישות האנרגטי הייחודי של הרשתית עצבית, בשילוב עם הגבלה חזק של אספקת הדם, מדידה מדויקת של צריכת ATP הרשתית ואת שלו משתנה במהלך המחלה עשויות להיות השלכות עמוקה תוך הבנה וטיפול מעלף מצבים כגון רטיניטיס פיגמנטוזה רטינופתיה סוכרתית. באופן מסורתי, מדידות אלה דורשים ציוד יקר, אישית מעוצבת עם רוב המחקרים מתוך קומץ של מעבדות שכולו מוקדש מדידות של פעילות חילוף החומרים2,5,6, 7,8. טכניקות כוללים מבחני בודדים של המטבוליטים ספציפיים, מחקרים מעקב באמצעות התווית על-ידי רדיו סימנים מקדימים, צריכת חמצן הקלטה באמצעות אלקטרודות קלארק, ו metabolomic פרופיל9.
עם ההתקדמות בטכנולוגיית תפוקה גבוהה וזמינות מוגברת של התקנים מסחריים, טכניקות כדי הרשומה מטבוליזם ברשתית הם יותר ויותר נגיש וזול. השיטה המתוארת כאן מודד בשני זרחון חמצוני, גליקוליזה רשתית העין באמצעות explanted רקמות ו זמין מסחרית השטף חוץ-תאית מנתח9,10,11,12. זה מנתח מתעדת בנפרד קצב צריכת החמצן (OCR), שער חוץ-תאית acidification (ECAR), הגשה אינדיקטורים עקיף של זרחון חמצוני, גליקוליזה, בהתאמה13. מדידות אלה נעשית על ידי בדיקה submersed במרחק microchamber שנוצרו על הרקמה של ריבית. זה עיבוד של שיטות שפורסמו בעבר משתמש צלחת לכידת תוכנן במקור עבור לנגרהנס בלבלב כדי להקליט את פעילות חילוף החומרים בסעיפים קטנים, עגולים של רשתית העכבר. חשיפות מרובות תרופתי יכול להיות מועברת הרקמה במהלך הקלטה יחיד כי המערכת מכילה 4 יציאות הזרקת עבור כל דגימה. טוב. באמצעות מערכת זו עם פרוטוקולים נפרד אופטימיזציה עבור הקלטות ECAR, OCR, התגובות של פראי-סוג באדמומיות ניתן להשוות הרשתיות חסר transducin (Gnat1– / –), סיבת עיוורון לילה נייח מולדות ב בני14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR, ECAR נמדדים ברצון ברקמת הרשתית explanted באמצעות bioanalyzer תוך שימוש בטכניקות המתואר. שיטה זו יוצאת מאלו של קבוצות אחרות במספר שלבים קריטיים. רקמות ברשתית מבודדים דרך חתך גדול הקרנית ללא enucleating העולם, כפי שהם במקור מתוארת על ידי וינקלר15. שיטה זו של בידוד ברשתית מאפשר העברה מהירה מעינ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר אלכסנדר Kolesnikov, ד ר ולדימיר Kefalov על מתן Gnat1– / –עכברים, משוב מועילים ועצות, ולכל לקרוא את כתב היד.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY025269 (RR), המרכז לחקר הסוכרת באוניברסיטת וושינגטון – NIH DK020579 (JRM ו- RR), פרס פיתוח הקריירה מן המחקר כדי למנוע עיוורון (RR), קרן Horncrest (RR), פרס פיתוח הקריירה של האגודה לסוכרת נעורים ( JRM), DK101392 NIH (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS), DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
