Arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche rara con nanoparticelle magnetiche
Summary
Cellule T antigene-specifiche sono difficili da caratterizzare o utilizzare in terapie grazie alla loro frequenza estremamente bassa. Qui, forniamo un protocollo per sviluppare una particella magnetica che si può associare a cellule T antigene-specifiche per arricchire queste cellule e quindi di espanderli diversi moltiplicati per la caratterizzazione e la terapia.
Abstract
Abbiamo sviluppato uno strumento per arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche. Ciò può essere utile in casi come A) rilevare l’esistenza di cellule T antigene-specifiche, B) sonda la dinamica delle risposte antigene-specifiche, C) capire come risposte antigene-specifiche influenzano lo stato di malattia come autoimmunità, D) demistificare eterogenei risposte per le cellule T antigene-specifiche, o E) utilizzano cellule antigene-specifiche per la terapia. Lo strumento si basa su una particella magnetica che abbiamo coniugato antigene-specifiche e segnali co-stimolatori delle cellule T, e che definiamo come artificiale antigene che presenta le cellule (aAPCs). Di conseguenza, poiché la tecnologia è semplice da produrre, si può facilmente essere adottata da altri laboratori; così, il nostro scopo qui è di descrivere dettagliatamente la fabbricazione e l’uso successivo della aAPCs. Spieghiamo come collegare segnali co-stimolatori e antigene-specifici per il aAPCs, come utilizzarli per arricchire di cellule T antigene-specifiche e come espandere le cellule T antigene-specifiche. Inoltre, evidenzieremo progettazione considerazioni basate su informazioni sperimentali e biologici della nostra esperienza con la caratterizzazione di cellule T antigene-specifiche.
Introduction
Con l’ascesa di molte immunoterapie, c’è la necessità di essere in grado di caratterizzare e controllare le risposte immunitarie. In particolare, la risposta immunitaria adattativa è di interesse a causa della specificità e la durata delle cellule. Recentemente, le terapie con cellule T-antigene-recettore chimerico sono state approvate per la terapia del cancro; Tuttavia, l’antigene-recettori sono basati fuori il comune cellula antigene di superficie CD19, invece gli antigeni specifici per il cancro1. Di là della specificità, immunoterapie possono anche soffrire la mancanza di controllo e limitata comprensione della risposta immunitaria dinamica all’interno di cancro o autoimmunità.
Una delle sfide di studiare risposte antigene-specifiche è la loro frequenza estremamente bassa, ad es., cellule T antigene-specifiche sono 1 di ogni 104 106 T cellule2,3. Così, per indagare quali T sono presenti cellule o blocca, le cellule hanno bisogno di essere arricchito e ampliato, o loro segnale bisogno di essere amplificato. È costoso e difficile da mantenere le cellule di alimentatore utilizzando le attuali tecniche che si concentrano sull’espansione delle cellule antigene-specifiche. Le attuali tecniche che si concentrano su amplificando il segnale di T antigene-specifiche cellule, come l’enzima-collegata immunospot (ELISPOT) dosaggio, limitare il riutilizzo di tali cellule di T4. Infine, a causa della bassa sensibilità, spesso queste due tecniche devono essere combinati per enumerazione antigene-specifici.
Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato l’antigene artificiale basata su nanoparticelle magnetiche presentazione cella (aAPC)5,6,7,8. Il aAPC possono essere funzionalizzati con un complesso antigene-specifico peptide segnale caricato istocompatibilità (pMHC) – e molecole costimolatorie –ad es., un anticorpo anti-CD28-ad entrambi arricchire cellule T antigene-specifiche e poi successivamente stimolare la loro espansione (Figura 1). Le particelle possono essere così un prodotto redditizio standard che possa essere sia personalizzato per soddisfare antigene-specifiche stimolazioni ancora standardizzato attraverso esperimenti e pazienti. Eseguendo l’arricchimento e l’espansione elaborare risultati in centinaia di migliaia-fold espansione di cellule CD8 + T antigene-specifiche e può provocare frequenze fino al 60% dopo appena una settimana, che permette la caratterizzazione o l’uso terapeutico di grandi numero di celle. Qui, descriviamo come fare aAPCs di nanoparticelle, alcune considerazioni di progettazione critici nella scelta delle proprietà delle nanoparticelle ed illustrano alcuni risultati tipici da utilizzando queste particelle in isolamento ed espansione raro antigene-specifiche cellule T CD8 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo creato una tecnologia di isolamento di romanzo delle cellule di T antigene-specifiche basata su nanoparticelle artificiale antigene che presenta le cellule (aAPCs). AAPCs di nanoparticelle hanno peptide-caricato MHC sulla superficie che permette l’associazione di cellule T antigene-specifiche e attivazione al fianco di costimolazione attivazione. aAPCs sono anche paramagnetico e quindi può essere utilizzato per arricchire le cellule T antigene-specifiche rare usando un campo magnetico. Abbiamo ottimizzato e stud…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H. grazie NIH cancro nanotecnologia Training Center presso il Johns Hopkins Institute per nanobiotecnologie, la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) e la Fondazione di archi per il supporto di borsa di studio. Questo lavoro è stato finanziato dal sostegno dei National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovation Initiative e la Fondazione di Coulter (JPS).
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
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