Flöde flödescytometrisk påvisa nybildade Stem Cell-liknande bröstcancerceller efter apoptos återföring
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera apoptotiska bröstcancerceller genom fluorescens-aktiverad cell sortering och ytterligare upptäcka övergången av bröstcancerceller att stamceller-liknande bröstcancerceller icke-stammen efter apoptos återföring av flödescytometri.
Abstract
Återfall har länge studerats av onkologer medan de bakomliggande mekanismerna är oklara. Nyligen hittade vi och andra som ett fenomen som heter apoptos återföring leder till ökad tumorigenicitetsprov i olika cellmodeller under olika stimuli. Tidigare studier har fokuserat på spåra denna process in vitro- och in vivo; isolering av verkligt omvända celler har dock ännu ska uppnås, vilket begränsar vår förståelse om konsekvenserna av apoptos återföring. Här, utnyttja vi kaspas-3/7 grön Detection färgämne till etikett celler med aktiverade kaspaserna efter apoptotiska induktion. Celler med positiva signaler sorteras ytterligare av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) för återställning. Morfologisk undersökning under konfokalmikroskopi hjälper till att bekräfta apoptotiska status innan FACS. En ökning av tumorigenicitetsprov kan ofta härledas till höjden procentandel av cancer stamceller (CSC)-som celler. Dessutom skulle ges heterogenitet av bröstcancer, att identifiera ursprunget av dessa CSC-liknande celler vara kritiska cancerbehandling. Således förbereda vi bröstcancerceller för icke-stammen innan utlöser apoptos, isolera kaspas-aktiverade celler och utföra apoptos återföring procedur. Flödescytometri Flödesanalys avslöjar att bröst CSC-liknande celler visas igen i gruppen omvända indikerar bröst CSC-liknande celler är transiterat från icke-stammen bröstcancerceller under apoptos återföring. Sammanfattningsvis innehåller detta protokoll isolering av apoptotiska bröstcancerceller och upptäckt av förändringar i CSC procentsats i omvänd celler av flödescytometri.
Introduction
Cancer har varit en ledande dödsorsak, orsakar tung börda till länder i hela världen1. Bröstcancer rankas högt både när det gäller incidens och dödlighet hos kvinnliga patienter bland alla typer av cancer1. På grund av cancer heterogenitet används vanligtvis en kombination av läkemedel för kemoterapi för att uppnå cancer cell death2,3,4. Eftersom vanliga cellgifter rikta ofta DNA5,6, påverkade proteinsyntes7,8 eller mikrotubulära dynamics9, snabbt växande celler är dock mest medan quiescent celler såsom cancer stamceller (CSC) s är oftast mindre drabbade10. CSCs är därför mer benägna att överleva efter behandlingen, som senare leder till läkemedelsresistens och cancer återfall10,11. Därför, eliminering av CSCs har blivit ett viktigt ämne för cancerbehandling och studie av CSCs ursprung är nödvändigt.
Fler studier på fenomenet apoptos återföring har utförts i det senaste decenniet12,13,14,15,16,17,18 , 19. före uppkomsten av detta begrepp, det har varit allmänt accepterat att celler oåterkalleligt kommer att genomgå apoptos efter kaspas aktivering. Kaspaserna är en familj av protein enzymer som spelar viktiga roller i de inledande och utförande stadierna av apoptos, inklusive bildandet av den komplexa apoptotiska och klyvning av nedströms substrat20. Aktivering av bödeln kaspaserna såsom kaspas 3 eller kaspas 7 har betraktats som den ”point of no return” för apoptos21. Dock konstaterats forskare nyligen att apoptos återföring sker både in vitro- och in vivo, under vilka celler kan återhämta sig från apoptos även efter kaspas aktiveringen12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Dessutom aggressiva funktioner såsom högre motstånd mot ursprungliga apoptotiska inducerare och högre invasivitet upptäcks i omvänd cancer cells15. Det föreslogs därför att procentandelen av CSC-liknande celler skulle vara högre i den omvända befolkningen jämfört med obehandlade cellerna, så småningom bidrar till mer maligna funktioner efter apoptos återföring18.
Tidigare, många ansträngningar har gjorts att spåra apoptos återföring och viktigare, in vivo som kraftigt bidra till bekräftar denna process16,17,19universalitet. Dock saknas en systemisk studie om konsekvenserna av omvänd celler på grund av den otillfredsställande isoleringen av celler som har verkligen genomgått apoptos återföring. Det finns ett behov av att förvärva pure apoptotiska celler och återställa dem för vidare studier. Således använder vi den traditionellt väl accepterade markören för bödeln kaspas aktivering som markeringen av ”point of no return”21 för apoptos och utnyttja fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) att diskriminera kaspas-aktiverade celler målat med kaspas-3/7 grön Detection färgämne. Färgen är kovalent kopplad till en kort aminosyrasekvens, DEVD, som kan identifieras och klyvs av aktiva kaspaserna 3/7. Klyvning hjälper släppa färgämnet, som kommer translocate från cytosolen till kärnan där det binder till DNA och avger stark fluorescens. Detta förfarande undviks med hjälp av en bulk cell befolkningen i vilken vissa celler inte kan ha genomgått apoptos.
CSCs eller tumör-inleda celler har identifierats i många solida tumörer med hjälp av en enda eller en kombination av flera ytan marker(s) och mycket få siffror av dessa celler är tillräckliga för att bilda tumörer i nedsatt immunförsvar möss22,23, 24,25,26,27. En kombination av CD44 och CD24 har vanligen använts i bröstet CSC studier och CD44+/CD24– celler har definierats som bröstet CSCs26,27,28,29 , 30. nyligen, vi har utfört en serie experiment för att bekräfta det föreslagna förhållandet mellan apoptos återföring och CSCs och demonstrera att omvända bröstcancerceller fick ökad tumör-bilda förmåga in vitro- och in vivo med en förhöjd procentandelen celler med CSC markörer18. Även om vi inte kunde utesluta möjligheten att bröst CSCs överleva bättre och därmed få berikad efter apoptos återföring, ännu viktigare, när vi isolerar icke-stammen cancerceller och ämne dem till apoptos omsvängning, CSC kommer att dyka upp i ursprungligen icke-stammen cancer cell befolkningen, tyder på att icke-stammen cancer celler kan bidra till ökningen av procentandelen av CSCs under apoptos återföring.
Denna artikel syftar till att demonstrera övergången från icke-stammen bröstcancerceller till bröst CSC-liknande celler efter apoptos återföring och upptäcka denna övergång av flödescytometri. De bröstcancer cellerna icke-stammen är initialt beredda genom att isolera CD44–/CD24+ breast cancerceller av FACS. Sedan är apoptos induceras och bekräftas av morfologiska förändringar under mikroskopet. Efteråt, apoptotiska celler positivt-märkt av kaspas 3/7 grön upptäckt dye har isolerats av FACS och ytterligare odlade i avsaknad av apoptotiska inducerare för apoptos återföring. Återförda cellerna färgas sedan med CSC markörer efter 7 dagars återhämtning för flöde flödescytometrisk analys. Celler med CD44+/CD24– markörer visas igen i den omvända befolkningen, vilket tyder på att övergången från icke-stammen cancerceller till CSC-liknande celler har inträffat under apoptos återföring.
Apoptos återföring har observerats i flera cancer cell linjer samt normal primära celler behandlas med olika apoptotiska stimuli i vitro12,13. Denna process har också spårats i Drosophila modell i vivo16,17,19. Mycket information om den underliggande mekanismen av cancer återfall i olika cancer sjukdomsmodeller och ursprunget till CSCs kan erhållas genom användning av tekniken som beskrivs i detta manuskript.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver ett direkt och tydligt sätt för att upptäcka icke-stammen bröstcancerceller övergång till bröst CSC-liknande celler till följd av apoptos återföring. Bekräftelse av CSC egenskaperna hos dessa omvända celler kan biträdas av använder jagn vitro mammosphere bildandet analys och i vivo xenograft transplantation i nedsatt immunförsvar möss18,24,26 ,<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av innovativa teknologi fond av Innovation Technology kommissionen: finansiering stöd från de statliga nyckel laboratorium av Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong biomedicinsk forskningsfonden och stiftelsen Lee Hysan. Y.X. stöddes av doktorandtjänst från CUHK.
Materials
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
References
- McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
- Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
- Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
- Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
- Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
- Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine). Recherche en cancérologie. 50 (14), 4417-4422 (1990).
- Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
- Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
- Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
- Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
- Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
- Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Recherche en cancérologie. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Recherche en cancérologie. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
- Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
- Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
- Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
- Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
- Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
- Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
- Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
- Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
- Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).
