Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules apoptotiques de cancer du sein par un tri de fluorescence-lancée de cellules et plus détecter le passage de cellules non souches du cancer du sein de cellules de cellules souches-comme pour le cancer du sein après le renversement de l’apoptose par cytométrie en flux.

Abstract

Récidive du cancer a longtemps étudié par les oncologues tandis que les mécanismes sous-jacents demeurent obscures. Récemment, nous et autres découvrirent qu’un phénomène appelé apoptose inversion entraîne tumorigénicité accrue dans différents modèles de cellule sous différents stimuli. Des études antérieures ont surtout portés sur le suivi de ce processus in vitro et in vivo ; Toutefois, l’isolement de cellules réelle inversées doit encore à atteindre, qui limite notre compréhension sur les conséquences de l’inversion de l’apoptose. Ici, nous profitons d’un colorant de la Caspase-3/7 vert détection pour marquer les cellules avec des caspases activés après l’induction de l’apoptose. Cellules avec des signaux positifs sont plus triés par cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour la récupération. L’examen morphologique en microscopie confocale permet de confirmer le statut d’apoptotic avant FACS. Une augmentation de la tumorigénicité peut souvent être attribuée à l’élévation du pourcentage de cellules de souches du cancer (SCC)-comme des cellules. Aussi, compte tenu de l’hétérogénéité du cancer du sein, identifier l’origine de ces cellules CSC serait essentiel pour le traitement du cancer. Ainsi, nous préparons des cellules-souches non cancéreuses du sein avant le déclenchement de l’apoptose, isoler les cellules activées caspase et effectuez la procédure d’inversion de l’apoptose. Analyse en cytométrie en flux révèle que cellules mammaires CSC ré-apparaissent dans le groupe inversé, indiquant les cellules mammaires CSC sont transités de cellules-souches non cancéreuses du sein au cours de l’inversion de l’apoptose. En résumé, ce protocole inclut l’isolement des cellules de cancer du sein apoptotic et détection des variations en pourcentage de la CSC dans les cellules inversées par cytométrie en flux.

Introduction

Le cancer a été des principales causes de la mort, provoquant le lourd fardeau aux pays dans le monde¹. Le cancer occupe un rang élevé, tant en termes d’incidence et de mortalité chez les femmes entre tous les types de cancer¹. En raison de l’hétérogénéité du cancer, une combinaison de médicaments est habituellement utilisée en chimiothérapie pour atteindre cancer cell death^2,3,4. Cependant, puisque la communes médicaments chimiothérapeutiques ciblent souvent ADN^5,6, synthèse^7,8 et/ou microtubule dynamique des protéines⁹, les cellules à croissance rapide sont touchés le plus tout en les cellules quiescentes comme cancer stem cell (CSC) s sont généralement moins touchées¹⁰. CSC n’est donc plus susceptibles de survivre après le traitement, qui conduit plus tard à la résistance aux médicaments et le cancer rechute^10,11. Par conséquent, élimination des CSC est devenu un sujet important pour le traitement du cancer et étude de l’origine des CSC est nécessaire.

D’autres études sur le phénomène de l’inversion de l’apoptose ont été réalisées dans les dix dernières années^{12,13,14,15,16,17,18 , 19}. avant l’émergence de ce concept, il a été largement acceptée que les cellules subiront irréversiblement l’apoptose après l’activation de la caspase. Caspases sont une famille d’enzymes de protéines qui jouent un rôle clé dans les stades initiation et l’exécution de l’apoptose, y compris la formation de complexes apoptotiques et le clivage des substrats en aval²⁰. Activation des caspases bourreau comme caspase 3 ou caspase 7 a été considérée comme le « point de non retour » pour l’apoptose²¹. Toutefois, les chercheurs ont observé récemment que l’apoptose inversion produit deux études in vitro et in vivo, au cours de laquelle les cellules peut récupérer l’apoptose même après caspase activation^{12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19}. en outre, caractéristiques agressives comme une résistance plus élevée à l’original inducteur d’apoptose et techniques plus invasives sont détectés dans le cancer inversé cellules¹⁵. Par conséquent, il a été proposé que le pourcentage de cellules semblables à des CSC serait plus élevé dans la population inversée par rapport aux cellules non traitées, éventuellement contribuer aux fonctionnalités plus malignes après l’apoptose inversion¹⁸.

Auparavant, beaucoup s’est efforcé de suivre le renversement de l’apoptose in vitro et, plus important encore, in vivo, qui contribuent grandement à confirmer l’universalité de ce processus^16,17,19. Cependant, une étude systémique sur les conséquences des cellules inversées manque en raison de l’isolement insatisfaisante des cellules qui ont véritablement fait l’objet d’inversion de l’apoptose. Il est nécessaire d’acquérir des cellules apoptotiques pure et les récupérer pour complément d’étude. Ainsi, nous utilisons le marqueur traditionnellement reconnu de l’activation des caspases bourreau comme marqueur du « point of no return »²¹ d’apoptose et utiliser la cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour discriminer les caspases activées cellules colorées avec de la teinture de la Caspase-3/7 vert détection. Le colorant est lié par covalence à une séquence d’acide aminés court, hanane, qui peut être reconnu et clivé par active caspases 3/7. Le clivage aide à libérer la teinture, qui va effectuer des transferts du cytosol vers le noyau où il se lie à l’ADN et émet une fluorescence forte. Cette procédure évite d’utiliser une population de cellules en vrac dans lequel certaines cellules ne peuvent pas avoir subi l’apoptose.

CCF ou déclenchant les tumeurs des cellules ont été identifiés dans nombreuses tumeurs solides à l’aide d’un seul ou une combinaison de plusieurs marqueurs de surface et très peu de nombre de ces cellules ne suffisent pas à former des tumeurs dans des souris immunodéficientes^{22,23, 24,25,26,27}. Une combinaison de CD44 et CD24 a été couramment utilisée dans les études du sein CSC et CD44⁺/CD24^– cellules ont été définis comme la poitrine CSC^{26,27,28,29 , 30}. récemment, nous avons effectué une série d’expériences pour confirmer la relation proposée entre le renversement de l’apoptose et CCS et démontrer que les cellules cancéreuses mammaires inversé acquise capacité accrue de formation tumorale in vitro et in vivo avec un pourcentage élevé de cellules avec des marqueurs de CSC¹⁸. Bien que nous ne pourrions pas exclure la possibilité que du sein CSCs survivent mieux et ainsi obtenir enrichis après le renversement de l’apoptose, ce qui est important, lorsque nous isoler des cellules souches non cancéreuses et sujet à l’inversion de l’apoptose, CSC verront le jour dans l’origine non souches population de cellules de cancer, ce qui suggère que non-souches du cancer, les cellules peuvent contribuer à l’augmentation du pourcentage de CSC au cours de l’inversion de l’apoptose.

Cet article a pour but de démontrer le passage de cellules-souches non cancéreuses du sein à CSC-comme les cellules du sein après le renversement de l’apoptose et de détecter cette transition par cytométrie en flux. Les cellules souches non cancéreuses sont préparés au départ en isolant CD44^–/CD24⁺ sein des cellules cancéreuses par FACS. Puis, l’apoptose est induite et confirmé par des changements morphologiques sous le microscope. Par la suite, les cellules apoptotiques positivement marqué par le colorant vert détection Caspase 3/7 sont isolées par FACS et ensuite mis en culture en l’absence d’apoptotic inducteurs d’inversion de l’apoptose. Les cellules inversés sont ensuite colorées avec des marqueurs de la CSC après 7 jours de récupération pour cytométrie. Cellules avec CD44⁺/CD24^– marqueurs reparaissent dans la population inversée, ce qui laisse supposer que transition entre cellules souches non cancéreuses et des cellules semblables à CSC est apparue au cours de l’inversion de l’apoptose.

Inversion de l’apoptose a été observée dans le cancer de plusieurs lignées cellulaires comme les cellules primaires normales traitées avec des stimuli apoptotiques différents en vitro^12,13. Ce processus a également été suivi chez la drosophile modèle in vivo^16,17,19. Beaucoup d’informations concernant le mécanisme sous-jacent de rechute du cancer dans les modèles de la maladie de cancer différents et l’origine des CSC peut être obtenue par l’utilisation de la technique que décrit dans ce manuscrit.

Protocol

1. préparation du cancer du sein Non-souches de cellules cancéreuses La culture MCF-7 et les cellules MDA-MB-231 dans 10 mL de milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sans rouge de phénol additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) dans un plat de 100 mm. Culture T47D dans 10 mL d’un milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol additionné de 2 mM de L-glutamine, 10 % inactivés par la chaleur SVF et 1 % v/v pénicilline-streptomycine (PS) dans un plat …

Representative Results

Afin d’observer la transition du sein non souches cellules cancéreuses à des cellules mammaires semblables à CSC, un premier tri de CD44–/CD24+ cellules cancéreuses du sein ont été nécessaires. Pour la lignée de cellules MCF-7, qui a environ 0,15 % cellules avec des marqueurs de CSC dans la population d’origine (Figure 1), cette étape a contribué à exclure la possibilité d’enrichissement de la CSC au cours de l’inve…

Discussion

Ce protocole décrit une manière directe et claire pour la détection de la transition des cellules mammaires cancéreuses non souches en cellules semblables à des CSC du sein en raison de l’inversion de l’apoptose. Confirmation des propriétés de ces cellules inversés CSC pourrait assistée à l’aide j’ain vitro mammosphere formation test et in vivo xénogreffe transplantation dans des souris immunodéficientes^18,24,<sup …

Materials

MCF-7	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-22
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
T47D	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate	Invitrogen	A35109
bovine serum albumin	USB	9048-46-8
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye	Invitrogen	C10423
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Fc block	Miltenyi Biotec	130-059-901
fetal bovine serum	Invitrogen	16000044	heat-inactivated
HEPES	USB	16926
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
L-glutamine	Invitrogen	25030081
Mitotracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512
monoclonal antibodies against human CD24	BD Biosciences	555428	PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44	BD Biosciences	560531	PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	554648	Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	558304	Clone:27-35 RRID:AB_647257
phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	21600010
propidium iodide	Invitrogen	P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium	Invitrogen	11835055	phenol red-free
sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
staurosporine	Sigma-Aldrich	S4400
Equipment
100 mm culture dish	Greiner Bio-One	664160
12-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	150628
Cell Strainer 40-μm nylon mesh	BD Biosciences	08-771-1
FACSuite software bundle v1.0	BD Biosciences	651360
FACSVerse	BD Biosciences	651155
FluoView FV1000 confocal microscope	Olympus	IX81	60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b	Olympus	–
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes	BD Biosciences	352003
S3e sorter	Bio-Rad	1451006