नव गठित स्तन कैंसर के प्रवाह Cytometric का पता लगाने के Apoptosis उत्क्रमण के बाद कोशिका की तरह स्टेम सेल
Summary
यहां, हम प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई द्वारा अपोप्तोटिक स्तन कैंसर की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और आगे प्रवाह cytometry द्वारा apoptosis उत्क्रमण के बाद स्तन कैंसर स्टेम कोशिका कोशिकाओं की तरह स्टेम कैंसर कोशिकाओं के संक्रमण का पता लगाने ।
Abstract
कैंसर पुनरावृत्ति लंबे समय अर्बुदविज्ञानी द्वारा अध्ययन किया गया है अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट रहते हैं । हाल ही में, हम और दूसरों को पता चला कि एक घटना apoptosis उलटा नाम विभिंन उत्तेजनाओं के तहत विभिंन सेल मॉडलों में वृद्धि हुई tumorigenicity की ओर जाता है । पिछले अध्ययनों में इस प्रक्रिया पर नज़र रखने पर ध्यान केंद्रित किया गया है इन विट्रो और vivo में; हालांकि, असली उलट कोशिकाओं के अलगाव अभी तक प्राप्त किया है, जो apoptosis उत्क्रमण के परिणामों पर हमारी समझ सीमा है । यहां, हम अपोप्तोटिक प्रेरण के बाद सक्रिय caspases के साथ कोशिकाओं लेबल करने के लिए एक Caspase-3/ सकारात्मक संकेतों वाले कक्ष आगे प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) द्वारा पुनर्प्राप्ति के लिए हल किए जाते हैं । फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत रूपात्मक परीक्षा FACS से पहले अपोप्तोटिक स्थिति की पुष्टि में मदद करता है । tumorigenicity में वृद्धि अक्सर कैंसर स्टेम सेल के प्रतिशत में उंनयन के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है (CSC)-कोशिकाओं की तरह । साथ ही, ब्रेस्ट कैंसर के विविधता को देखते हुए इन सीएससी की उत्पत्ति की पहचान-जैसे कोशिकाएं कैंसर के इलाज के लिए अहम होंगी । इस प्रकार, हम apoptosis ट्रिगर से पहले स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं तैयार, caspase-सक्रिय कोशिकाओं को अलग और apoptosis उलटा प्रक्रिया प्रदर्शन. प्रवाह cytometry विश्लेषण से पता चलता है कि स्तन सीएससी की तरह कोशिकाओं को फिर से उलट समूह में दिखाई देते हैं, का संकेत स्तन सीएससी की तरह कोशिकाओं apoptosis उत्क्रमण के दौरान स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं से पारगमन कर रहे हैं । संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल अपोप्तोटिक स्तन कैंसर की कोशिकाओं के अलगाव और प्रवाह cytometry द्वारा उलट कोशिकाओं में CSC प्रतिशत में परिवर्तन का पता लगाने के शामिल हैं ।
Introduction
कैंसर की मौत का एक प्रमुख कारण रहा है, भारी बोझ के कारण दुनिया भर में देशों1। स्तन कैंसर1कैंसर के सभी प्रकार के बीच महिला रोगियों में घटना और मृत्यु के मामले में दोनों उच्च रैंकों । कैंसर विविधता के कारण, दवाओं का एक संयोजन आमतौर पर कीमोथेरेपी में प्रयोग किया जाता है कैंसर कोशिका मृत्यु2,3,4प्राप्त करने के लिए । हालांकि, के बाद से आम कीमोथेरेपी दवाओं अक्सर लक्ष्य डीएनए5,6, प्रोटीन संश्लेषण7,8 और/या microtubule गतिशीलता9, तेजी से बढ़ती कोशिकाओं को सबसे अधिक प्रभावित कर रहे हैं, जबकि quiescent कोशिकाओं जैसे कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) एस आमतौर पर कम10प्रभावित कर रहे हैं । सीएससीएस कर रहे हैं, इसलिए, अधिक उपचार के बाद जीवित रहने की संभावना है, जो बाद में दवा प्रतिरोध और कैंसर पतन10,11की ओर जाता है । इसलिए, सीएससीएस के उंमूलन कैंसर के इलाज के लिए एक महत्वपूर्ण विषय बन गया है और सीएससीएस के मूल के अध्ययन के लिए आवश्यक है ।
apoptosis उत्क्रमण की घटना पर अधिक अध्ययन हाल के दशक में प्रदर्शन किया गया है12,13,14,15,16,17,18 , 19. इस अवधारणा के उद्भव से पहले, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि कोशिकाओं को caspase सक्रियण के बाद apoptosis से गुजरना होगा अचल । Caspases प्रोटीन एंजाइमों के एक परिवार है कि दीक्षा और apoptosis के निष्पादन चरणों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं, अपोप्तोटिक परिसर के गठन और बहाव सब्सट्रेट20के दरार सहित । caspase 3 या caspase 7 के रूप में जल्लाद caspases के सक्रियकरण21apoptosis के लिए नहीं वापसी की “बिंदु” के रूप में माना गया है । हालांकि, शोधकर्ताओं ने हाल ही में कहा कि apoptosis उलटा दोनों विट्रो में और vivo में होता है, जो के दौरान कोशिकाओं apoptosis से उबरने के बाद भी caspase सक्रियण12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. इसके अलावा, इस तरह के मूल अपोप्तोटिक उत्प्रेरण और उच्च इनवेसिव के लिए उच्च प्रतिरोध के रूप में आक्रामक सुविधाओं उलट कैंसर कोशिकाओं में पता लगाया है15। इसलिए, यह प्रस्तावित किया गया था कि सीएससी की तरह कोशिकाओं का प्रतिशत उलट आबादी में उच्च होगा जब अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में, अंततः apoptosis उलटा18के बाद और अधिक घातक सुविधाओं के लिए योगदान ।
पहले, कई प्रयासों में apoptosis उलटा ट्रैक करने के लिए किया गया है और अधिक महत्वपूर्ण बात, vivo में, जो बहुत इस प्रक्रिया की सार्वभौमिकता की पुष्टि करने में मदद16,17,19. हालांकि, उलट कोशिकाओं के परिणामों पर एक प्रणालीगत अध्ययन कोशिकाओं है कि वास्तव में apoptosis उत्क्रमणीय है की असंतोषजनक अलगाव के कारण कमी है । शुद्ध अपोप्तोटिक कोशिकाओं के अधिग्रहण और आगे के अध्ययन के लिए उन्हें ठीक करने की जरूरत है । इस प्रकार, हम जल्लाद caspase सक्रियकरण की पारंपरिक रूप से अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है मार्कर का उपयोग करें “कोई वापसी के बिंदु के मार्कर के रूप में”21 apoptosis के लिए और उपयोग प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) भेदभाव caspase-सक्रिय कोशिकाओं को दाग Caspase-3/7 ग्रीन डिटेक्शन डाई के साथ । डाई covalently एक छोटे एमिनो एसिड अनुक्रम, DEVD, जो पहचाना जा सकता है और सक्रिय caspases 3/7 से सट से जुड़ा हुआ है । दरार डाई रिलीज में मदद करता है, जो नाभिक को cytosol से translocate जहां यह डीएनए के लिए बांध और मजबूत प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करेगा । यह कार्यविधि बल्क सेल जनसंख्या का उपयोग करने से बचती है जिसमें कुछ कक्ष हो सकते है apoptosis नहीं आए हैं ।
सीएससीएस या ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं कई ठोस ट्यूमर में पहचान की गई है एक एकल या कई सतह मार्कर (ओं) का एक संयोजन का उपयोग कर और इन कोशिकाओं की बहुत कुछ संख्या immunodeficient चूहों में ट्यूमर फार्म करने के लिए पर्याप्त हैं22,23, 24,25,26,27. CD44 और CD24 का एक संयोजन आमतौर पर स्तन सीएससी अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, और CD44+/CD24– कोशिकाओं स्तन सीएससीएस के रूप में परिभाषित किया गया है26,27,28,29 , 30. हाल ही में, हम apoptosis उत्क्रमण और सीएससीएस के बीच प्रस्तावित संबंधों की पुष्टि करने के लिए प्रयोगों की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया है और यह दर्शाता है कि स्तन कैंसर कोशिकाओं में वृद्धि ट्यूमर बनाने की क्षमता इन विट्रो में और एक साथ vivo में प्राप्त सीएससी मार्करों के साथ कोशिकाओं का ऊंचा प्रतिशत18. हालांकि हम संभावना है कि स्तन सीएससीएस बेहतर जीवित है और इस तरह apoptosis उत्क्रमण के बाद समृद्ध हो बाहर नहीं कर सकता है, महत्वपूर्ण बात, जब हम अलग गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं और उंहें apoptosis उत्क्रमण के अधीन, CSC मूल रूप से गैर स्टेम में उभर जाएगा कैंसर कोशिका जनसंख्या, सुझाव है कि गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं apoptosis उत्क्रमण के दौरान सीएससीएस के प्रतिशत में वृद्धि करने के लिए योगदान कर सकते हैं ।
इस लेख के लिए स्तन गैर से संक्रमण का प्रदर्शन करना है स्टेम कैंसर कोशिकाओं apoptosis उत्क्रमण के बाद स्तन CSC-कोशिकाओं की तरह है और प्रवाह cytometry द्वारा इस संक्रमण का पता लगाने के लिए । स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं शुरू में FACS द्वारा CD44–/CD24+ स्तन कैंसर की कोशिकाओं को अलग करके तैयार कर रहे हैं । फिर, apoptosis प्रेरित और माइक्रोस्कोप के तहत रूपात्मक परिवर्तन की पुष्टि की है । बाद में, अपोप्तोटिक कोशिकाओं सकारात्मक-Caspase द्वारा लेबल 3/7 ग्रीन डिटेक्शन डाई FACS द्वारा अलग कर रहे हैं और आगे apoptosis उत्क्रमण के लिए अपोप्तोटिक उत्प्रेरण के अभाव में प्रसंस्कृत. रिवर्स कोशिकाओं तो प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए वसूली के 7 दिनों के बाद सीएससी मार्करों के साथ दाग रहे हैं । CD44 के साथ कोशिकाओं+/CD24– मार्करों रिवर्स जनसंख्या में फिर से दिखाई देते हैं, का सुझाव है कि गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं से सीएससी की तरह कोशिकाओं में संक्रमण apoptosis उत्क्रमण के दौरान हुई है ।
Apoptosis उत्क्रमण में देखा गया है एकाधिक कैंसर सेल लाइनों के साथ ही सामांय प्राथमिक इन विट्रो में विभिंन अपोप्तोटिक उत्तेजनाओं के साथ इलाज कोशिकाओं12,13। वीवो16,17,19में Drosophila मॉडल में भी यह प्रक्रिया ट्रेस की गई है । बहुत अलग कैंसर रोग मॉडल और सीएससीएस की उत्पत्ति में कैंसर पतन के अंतर्निहित तंत्र के बारे में जानकारी तकनीक के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है के रूप में इस पांडुलिपि में वर्णित है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल apoptosis उत्क्रमण का एक परिणाम के रूप में स्तन CSC-जैसे कोशिकाओं में स्तन गैर स्टेम कैंसर कोशिकाओं के संक्रमण का पता लगाने के लिए एक सीधा और स्पष्ट तरीका का वर्णन । इन उलट कोशिकाओं के CSC गुणों की पु?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम नवाचार प्रौद्योगिकी आयोग के अभिनव प्रौद्योगिकी कोष द्वारा समर्थित किया गया था: Agrobiotechnology (CUHK), लो Kwee-Seong बायोमेडिकल रिसर्च फंड और ली Hysan फाउंडेशन की राज्य कुंजी प्रयोगशाला से फंडिंग समर्थन । Y.X. CUHK से स्नातकोत्तर की छात्राओं ने समर्थन किया ।
Materials
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
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