Detección del flujo Cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la Apoptosis

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar células de cáncer de mama apoptóticas clasificación celular activado por fluorescencia y más detectar la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama cáncer células madre células después de la revocación de la apoptosis por citometría de flujo.

Abstract

La recurrencia del cáncer durante mucho tiempo ha sido estudiada por oncólogos mientras que los mecanismos subyacentes siguen siendo confusos. Recientemente, nosotros y otros encontraron que un fenómeno llamado inversión de apoptosis conduce a mayor colonización en varios modelos de celular bajo diferentes estímulos. Estudios previos se han centrado en el seguimiento de este proceso in vitro e in vivo; sin embargo, el aislamiento de células real invertidas tiene todavía ser alcanzado, que limita nuestro entendimiento sobre las consecuencias de la revocación de la apoptosis. Aquí, aprovechamos un tinte verde detección de caspasa-3/7 a las células de etiqueta con caspasas activadas después de la inducción de apoptosis. Células con señales positivas se clasifican más lejos hacia fuera por celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación para la recuperación. Examen bajo microscopia confocal ayuda a confirmar el estado de apoptosis antes de FACS. Un aumento en la colonización se puede atribuir a menudo a la elevación en el porcentaje de células madre de cáncer (CSC)-como las células. Además, dada la heterogeneidad del cáncer de mama, identificando el origen de estas células de CSC-como sería fundamental para el tratamiento del cáncer. Así, preparamos las células de cáncer no madre mama antes de accionar apoptosis, aislar células caspasa activa y realizar el procedimiento de revocación de la apoptosis. Análisis de citometría de flujo revela que mama CSC-como las células vuelve a aparecerán en el grupo inverso, indicando mama CSC-como las células se transitó de las células de cáncer no madre mama durante apoptosis revocación. En Resumen, este protocolo incluye el aislamiento de apoptotic células de cáncer de mama y la detección de cambios en porcentaje de CSC en células invertidas por citometría de flujo.

Introduction

Cáncer ha sido la principal causa de muerte, haciendo que la pesada carga a los países a nivel mundial¹. El cáncer de mama es alta tanto en términos de incidencia y mortalidad en pacientes femeninos entre todos los tipos de cáncer¹. Debido a la heterogeneidad del cáncer, una combinación de fármacos se utiliza generalmente en la quimioterapia para lograr cáncer célula muerte^2,3,4. Sin embargo, puesto que los medicamentos quimioterapéuticos comunes a menudo destino ADN^5,6, proteína síntesis^7,8 o microtúbulos dinámica⁹, las células de rápido crecimiento son afectados la mayoría mientras que células quiescentes como cáncer células madre (CSC) s son generalmente menos afectados¹⁰. CSCs son, por lo tanto, más posibilidades de sobrevivir después del tratamiento, que más adelante conduce a resistencia a los medicamentos y el cáncer recidiva^10,11. Por lo tanto, eliminación del CSC se ha convertido en un tema importante para el tratamiento del cáncer y estudio del origen de las CMC es necesario.

Se han realizado más estudios sobre el fenómeno de la reversión de la apoptosis en la última década^{12,13,14,15,16,17,18 , 19}. antes de la aparición de este concepto, ha sido ampliamente aceptado que las células irreversiblemente sufrirá apoptosis después de la activación de caspasas. Caspasas son una familia de enzimas de proteína que desempeñan papeles claves en las etapas de iniciación y ejecución de la apoptosis, incluyendo la formación de la apoptosis complejas y la división de downstream sustratos²⁰. Activación de las caspasas verdugo como caspasa 7 caspasa 3 ha sido considerada como el “punto de no retorno” para apoptosis²¹. Sin embargo, los investigadores observaron recientemente que apoptosis revocación ocurre in vitro y en vivo, en que las células pueden recuperar de apoptosis incluso después de la activación de caspasa^{12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19}. por otra parte, de características agresivas tales como mayor resistencia a la original inductor de apoptosis y mayor invasividad se detectan en el cáncer invertido células¹⁵. Por lo tanto, se propuso que el porcentaje de CSC-como las células sería mayor en la población invertida en comparación con las células sin tratar, eventualmente contribuir a las características más malas después de apoptosis revocación¹⁸.

Anteriormente, muchos esfuerzos se hicieron un seguimiento de la inversión de apoptosis in vitro y lo más importante, en vivo, que de gran ayuda para confirmar la universalidad de este proceso^16,17,19. Sin embargo, carece de un estudio sistémico sobre las consecuencias de las células invertidas debido al aislamiento insuficiente de las células que han sufrido realmente apoptosis revocación. Hay que adquirir las células apoptotic puro y recuperarlos para un estudio más profundo. Por lo tanto, utilizamos el marcador bien aceptado tradicionalmente de la activación de caspasas verdugo como el marcador del “punto de no retorno”²¹ para apoptosis y utilizar celular activado por fluorescencia (FACS) para discriminar caspase-activado Células teñidas de clasificación con colorante verde detección de caspasa-3/7. El tinte es covalente a una secuencia corta de aminoácidos, DEVD, que puede ser reconocido y hendida por activa caspasas 3/7. El escote ayuda a liberar el tinte, que se translocan desde el citosol al núcleo donde se une al ADN y emite fluorescencia fuerte. Este procedimiento evita el uso de una población de células a granel en la que algunas células pueden no han experimentado apoptosis.

CSC o células iniciadoras del tumor se han identificado en muchos tumores sólidos con una sola o una combinación de varios marcador superficial y muy pocos números de estas células son suficientes para los tumores en ratones inmunodeficientes,^{22,23, forma 24,25,26,27}. Una combinación de CD44 y CD24 se ha utilizado comúnmente en estudios de mama CSC y CD44⁺/CD24^– las células han sido definidas como la mama CSC^{26,27,28,29 , 30}. recientemente, hemos realizado una serie de experimentos para confirmar la relación propuesta entre la revocación de la apoptosis y las CMC y demostrar que las células de cáncer de mama invertida ganaron mayor capacidad de formación de tumor in vitro e in vivo con un elevado porcentaje de células con marcadores de CSC¹⁸. Aunque no podríamos excluir la posibilidad de que mama CSCs sobreviven mejores y así conseguirán enriquecidos después de la revocación de la apoptosis, cuando aislamos las células cancerosas no madre y sujeto a revocación del apoptosis, CSC surgirá en el originalmente no-vástago de población de células de cáncer, lo que sugiere que no tallo cáncer de las células pueden contribuir al aumento en el porcentaje de CSC durante apoptosis revocación.

Este artículo pretende demostrar la transición de las células de cáncer no madre mama a Mama CSC-como las células después de la revocación de la apoptosis y detectar esta transición mediante citometría de flujo. Las células de vástago no cáncer de mama se preparan inicialmente aislando CD44^–/CD24⁺ de mama las células cancerosas por FACS. Entonces, apoptosis es inducida y confirmado por cambios morfológicos bajo el microscopio. Luego, las células apoptotic positivamente marcado por el tinte verde detección de caspasas 3/7 son aisladas por FACS y más cultivadas en ausencia de inductores de apoptosis apoptosis inversión. Las células invertidas luego se tiñen con marcadores de CSC después de 7 días de recuperación para el análisis cytometric del flujo. Células con CD44⁺/CD24^– marcadores vuelve a aparecerán en la población invertida, sugiriendo que la transición de las células cancerosas no madre a CSC-como las células ha sufrido durante apoptosis revocación.

Revocación de apoptosis se ha observado en el cáncer de varias líneas celulares como las células normales de primaria tratados con estímulos apoptóticos diferentes en vitro^12,13. Este proceso también ha sido trazado en Drosophila en vivo^16,17,19del modelo. Toda la información sobre el mecanismo subyacente de la recaída del cáncer en modelos de enfermedad de cáncer diferentes y el origen de las CMC puede obtenerse mediante el uso de la técnica como se describe en este manuscrito.

Protocol

1. preparación de mama las células cancerosas no madre Cultura MCF-7 y MDA-MB-231 células en 10 mL de rojo de fenol libre Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) en un plato de 100 mm. Cultura T47D en 10 mL de rojo de fenol libre RPMI 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, 10% inactivado con calor FBS y 1% v/v penicilina-estreptomicina (PS) en un plato de 100 mm. Células en cultivo a 37 ° C en un incubador 95% aire cé…

Representative Results

Para observar la transición del pecho no tallo las células cancerosas de mama CSC-como las células, una primera clasificación de CD44–/CD24+ se necesitan las células de cáncer de mama. Para la línea de células MCF-7, que alrededor del 0.15% células con marcadores de CSC en la población original (figura 1), este paso contribuyó a excluir la posibilidad de enriquecimiento del CSC durante apoptosis revocación. Por el contrario…

Discussion

Este protocolo describe una manera directa y clara para la detección de la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama CSC-como las células como resultado de la revocación de la apoptosis. Confirmación de las propiedades de la CSC de estas células invertidas podría ser asistido usando n vitro mammosphere formación ensayo y en vivo xenograft trasplante en ratones inmunodeficientes^{18,24,26 </su…}

Materials

MCF-7	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-22
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
T47D	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate	Invitrogen	A35109
bovine serum albumin	USB	9048-46-8
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye	Invitrogen	C10423
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Fc block	Miltenyi Biotec	130-059-901
fetal bovine serum	Invitrogen	16000044	heat-inactivated
HEPES	USB	16926
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
L-glutamine	Invitrogen	25030081
Mitotracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512
monoclonal antibodies against human CD24	BD Biosciences	555428	PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44	BD Biosciences	560531	PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	554648	Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	558304	Clone:27-35 RRID:AB_647257
phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	21600010
propidium iodide	Invitrogen	P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium	Invitrogen	11835055	phenol red-free
sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
staurosporine	Sigma-Aldrich	S4400
Equipment
100 mm culture dish	Greiner Bio-One	664160
12-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	150628
Cell Strainer 40-μm nylon mesh	BD Biosciences	08-771-1
FACSuite software bundle v1.0	BD Biosciences	651360
FACSVerse	BD Biosciences	651155
FluoView FV1000 confocal microscope	Olympus	IX81	60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b	Olympus	–
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes	BD Biosciences	352003
S3e sorter	Bio-Rad	1451006