Vi beskriver protokoller for at bruge den brede field-of-view nematodeprøveudtagning sporing platform (WF-NTP), som giver høj overførselshastighed fænotypiske karakterisering af store populationer af Caenorhabditis elegans. Disse protokoller kan bruges til at karakterisere subtile adfærdsmæssige ændringer i mutantstammen eller svar til farmakologisk behandling i en yderst skalerbar mode.
Caenorhabditis elegans er en veletableret dyremodel i biomedicinsk forskning, bredt ansat i funktionel genomforskning og aldring undersøgelser. For at vurdere sundhed og fitness af dyr under undersøgelsen, er en typisk afhængig af motilitet udlæsninger, såsom måling af antallet af kroppen bøjninger eller hastighed af bevægelse. Disse målinger indebære normalt manuel optælling, at gøre det udfordrende at opnå god Statistisk signifikans, som tid og arbejdskraft begrænsninger ofte begrænse antallet af dyr i hvert forsøg til 25 eller mindre. Da høj statistiske effekt er nødvendige for at opnå reproducerbare resultater og begrænsning af falske positive og negative resultater, når svage fænotypisk virkninger er undersøgt, har for nylig gjort en indsats at udvikle automatiserede protokoller fokuseret på at øge den følsomhed af motilitet påvisning og multi parametrisk adfærdsmæssige profilering. For at udvide påvisningsgrænsen til det niveau, der er nødvendig for at fange de små fænotypiske forandringer, der er ofte afgørende for genetiske undersøgelser og drug discovery, beskriver vi her en teknologisk udvikling, der giver mulighed for undersøgelse af op til 5.000 individuelle dyr samtidig øge den statistiske effekt af målinger af 1.000-fold i forhold omkring til manuel assays og 100 i forhold omkring til andre tilgængelige automatiserede metoder.
Omkring et halvt århundrede siden, Sydney Brenner indført Caenorhabditis elegans (C. elegans) som et modelsystem til at undersøge udviklingen og Neurobiologi, som denne lille (1 mm i længden), gennemsigtig ødelægge orm er let at manipulere genetisk og vedligeholdelse i laboratorium1. I dag er bruges C. elegans til at studere en bred vifte af biologiske processer herunder apoptose, celle signalering, arten af cellecyklus, genregulering, stofskifte, og aldring2. Desuden, den cellulære og væv kompleksitet, protein udtryk mønstre og bevarelse af sygdom veje mellem C. elegans og højere organismer (80% af ormen gener har en menneskelig orthologue), forbundet med enkelhed og omkostningseffektiviteten ved dyrkning, gør det en effektiv i vivo model organisme imødekommenhed over for høj overførselshastighed genetiske3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 og narkotika14,15,16 screeninger. Af alle disse grunde, har C. elegans været ansat i karakterisering af normale og sygdomsrelaterede molekylære veje; i feltet i neurodegeneration, for eksempel, har det aktiveret udforskning af virkningerne af aldring på protein sammenlægning3,4,7,15,17, 18, og karakterisering af initiativtagerne og hæmmere af protein sammenlægning3,4,5,6,7,14, 18.
Den generelle kondition af orme, som er en vigtig adfærdsmæssige parameter skal defineres i denne type af undersøgelse, kan måles manuelt i en række forskellige måder, f.eks ved at tælle antallet af kroppen bøjninger pr. minut (BPM)4,6, 19, eller ved at måle hastigheden af bevægelse20,21,22, samt ved at måle den gennemsnitlige levetid og -satserne for lammelse. Selv om manuelle målinger af kroppen bøjninger og hastighed af bevægelse har ført til mange vigtige indsigt i en række forskellige molekylære veje og mekanismer3,4,14,19, 20,23, manuel assays forbliver i øjeblikket low-overførselshastighed, meget arbejdskrævende og tidskrævende samtidig være tilbøjelig til at fejl og menneskelige bias. Disse spørgsmål give betydelige udfordringer i indsamlingen af data tilstrækkelige statistiske magt til at skelne diskrete adfærdsændringer. Denne begrænsning er særlig relevant for stof screening som behandlinger med potentielle drug molekyler fører ofte til små fænotypiske forandringer24, derfor kræver undersøgelse af et stort antal dyr for at erhverve reproducerbare resultater. For at illustrere dette, har nylige undersøgelser vist, at en høj effekt af afsløring (POD) er nødvendigt at definere med tillid til nogen væsentlige ændringer i adfærd og begrænse falske positive resultater25. Dette har resulteret i en stærk motivation i C. elegans Fællesskabet at erstatte manuel optælling med reproducerbar, automatiserede, tid – og omkostninger – effective målinger. For at imødekomme denne efterspørgsel, har flere laboratorier for nylig udviklet metoder for Højfølsom målinger og nøjagtige orm sporing af større antal orme22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
For at udvide yderligere automatisering proces til de store kohorter af dyr behov for statistisk signifikant målinger, har vi for nylig udviklet et bredt felt-of-view nematode sporing platform (WF-NTP)15,34 ,35,36, der muliggør samtidige undersøgelse af flere fænotypiske udlæsninger på meget store orm populationer, en nøglefaktor i statistisk relevante phenotypical påvisning25. Ikke blot kan WF-NTP i øjeblikket overvåge op til 5.000 dyr parallelt, men fænotypisk udlæsninger også omfatter flere parametre, herunder de hastighed og amplitude af kroppen bøjninger, hastighed bevægelighed, brøkdel af befolkningen, der er lammet, og de størrelsen af dyrene. Det er derfor let muligt at skærmen tusindvis af orme i parallel og at kombinere de forskellige udlæsninger i en adfærdsmæssige kort til at oprette en flerdimensional fingerprint36. Den tilknyttede open source-software er skrevet i Python, hvilket er også forpligtet til at betjene det og er helt tilpasselig. En grafisk brugergrænseflade (GUI) tilbydes også til at give brugerne mulighed at vedtage denne teknologi.
Her præsenterer vi en række protokoller, der illustrerer nogle af de potentielle anvendelser af WF-NTP. Især vi diskuterer administration af forbindelser, lige fra små molekyler til protein therapeutics, og beskrive, hvordan til at screene deres virkninger direkte over store bestande af orme, således effektivt at fjerne behovet for at prøve lille delpopulationer. Brug af WF-NTP til et sådant formål har allerede bragt betydelige fordele i procedurer til designer drug discovery programmer af Alzheimers sygdom (AD)15,34,35 og Parkinsons sygdom (PD)18 ved hjælp af in vivo data for vurderingen af terapeutiske kandidater35,37.
På grund af den hurtige ekspansion af teknikker inden for optiske videnskaber er det nu muligt at imødegå kravet om automatiserede metoder i C. elegans undersøgelser i væsentlig grad nye måder. Som et resultat, en række digitale tracking platforme20,41,42,43,44,45,46 er blevet designet og stilles til rådighed over de sidste par år for at erstatte manuel optælling af parametre såsom hastighed bevægelighed, bøjning frekvens, lammelse sats, såvel som mere komplekse former for adfærd, såsom omega sving og levetid målinger. De nyeste automatiserede platforme har væsentligt forbedret reproducerbarhed og følsomhed af C. elegans undersøgelser41 og data af høj kvalitet på små årgange eller endog enkelte dyr. Vi besluttede at udvide automatisering af analysen af ormen opførsel gør det også muligt at evaluere fænotyper af kohorter af tusindvis af dyr i parallel. Den største fordel ved tilgang til at studere orm kohorter er at det giver for regnskab for høj iboende variabiliteten af ormen adfærd24 og for, at narkotika behandling undersøgelser fører ofte til subtile fænotypiske variationer, som er vanskelig at opdage med tilstrækkelig Statistisk signifikans, når ved hjælp af en lille gruppe af dyr. En høj effekt af afsløring (POD) er nødvendigt at registrere med tillid nogen betydelig ændring i adfærd og begrænse falske positive resultater25.
Her har vi beskrevet en række protokoller baseret på en nylig rapporteret automatiseret screeningsmetode for C. elegans, bred field-of-view fyrretræsnematoden sporing platform (WF-NTP)36. Protokollen beskrevet her er opdelt i 5 dele. Del 1 og 2 beskriver forberedelsen af store orm populationer. Kritiske trin er sterilitet af arbejdsforholdene og forberedelse af reagenser og plader nødvendigt at køre eksperimenter. Vi noterer os, at det på grund af den øgede overførselshastighed leveres af denne protokol, i forhold til andre screening metoder36, også kræver øgede mængder af reagenser denne faktor skal overvejes nøje i den eksperimentelle design. Vi bemærker også, at trinnet blegning er kritisk og skal være testet på forhånd som et stort antal æg og sunde larver er nødvendige for at køre disse eksperimenter. Del 3 af denne protokol detaljer om, hvordan til at levere narkotika i solid media og skærmen orm populationer. Vi bemærke, at denne del af protokollen er stærkt afhængig af antallet af narkotika og narkotikamisbrug koncentrationer skal testes af brugeren i parallel. Komplet automatisering af sikkerhedsundersøgelsen og hurtig datafangst Skift den begrænsende trin fra adfærdsmæssige observation reagens og vækst og synkronisering af store orm populationer. De vigtigste skridt under den adfærdsmæssige screening er tider af optagelsen og enhver orm behandling trin (f.eks., overførsel af orme fra NGM plader til sporing platform). Protokollen beskrevet her er et eksempel, designet til at screene orme for op til 9 dage i løbet af de voksne levetid; denne protokol kan dog let tilpasses til skærmen så mange gang point som brugeren ønsker f.eks., 18 dage i træk36. Del 4 derefter illustrerer anvendelsen af protokollen til at levere proteinmolekyler (fx, antistoffer og molekylære chaperoner) i C. elegans, og viser hvordan den protokol, der er illustreret i dele 1-3 kan nemt tilpasses, afhængigt af den ønskede ansøgning. Vi demonstrere, hvordan denne procedure kan være udvidet ikke kun til leveringen af narkotika-lignende molekyler, men også for administrationen af molekylære chaperoner eller antistoffer37. De første fire trin (dele) foregår under sterile forhold, medmindre andet er anført. Alle flydende komponenter bør være autoklaveres før brug og inkubation trin skal udføres på 70% relativ luftfugtighed. I Del5 beskriver vi hvordan man bruger softwarepakken leveres i kombination med tracking fase. Denne software har været custom designet til analyse af WF-NTP data relateret til funktionen af store orm populationer. Vi foreslår, at brugeren følger de retningslinjer, der er fastsat i Del5 dataanalyse; disse parametre er dog afhængig af de specifikke funktioner af de optagede videoer (dvs, fps, synsfelt, video opløsning, antal erhvervede rammer). Funktionen eksempel i GUI er udviklet til at lette evalueringen af de korrekte parametre før analysen.
Disse serier af protokoller gør det muligt at analysere fænotyper af store populationer af C. elegans (i øjeblikket op til 5.000 individuelle orme parallelt) effektivt, reducere artefakter på grund af den iboende variation af opførsel af dyrene , efter aftale med forundersøgelser på magten i registrering nødvendig for at opnå Statistisk signifikans for studier af C. elegans25. Platformen bruger et system af højopløselige kameraer, kan optage billeder af stort antal dyr på en høj hastighed, mens samtidig optagelse flere store kohorter. Høj ydeevne og høj produktivitet af WF-NTP-protokollen gør det muligt at bestemme meget små ændringer i orm adfærd i en meget præcis måde. Derfor, denne metode gør det muligt for nye metoder skal betragtes ikke kun for studiet af biologi C. elegans, men desuden for farmakologiske og medicinske forskning, såsom high throughput screening af genetiske modifikationer og stof behandlinger. Denne procedure har også fordelen, at lammelse undersøgelser skal udføres i parallel med andre adfærdsmæssige målinger, et centralt element i molekylær screening studies.
De resultater, der hidtil er opnået i drug discovery programmer AD15,34,35 og PD18 påvise betydningen af brede field-of-view dataopsamling i væsentlig grad øge de antal dyr, der kan overvåges i et enkelt eksperiment, derved betydeligt reducere de eksperimentelle fejl og væsentligt forbedre den statistiske gyldighed undersøgelser. Mens den nuværende tilgang, der er beskrevet i denne protokol har fokuseret på udfordringer inden for drug discovery, vi håber, at metoden, der vil være udbredt i Fællesskabet, og at dens anvendelse vil blive udvidet til komplekse genetiske og adfærdsmæssige undersøgelser og udvide antallet af fænotyper, der er i øjeblikket kan spores.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af centret for misfoldning sygdomme (CMD). FAA er understøttet af en Senior Research Fellowship award fra Alzheimers Society, UK (Grant antallet 317, AS-SF-16-003). C. elegans stammer blev fremstillet af Caenorhabditis elegans genetiske Centre (CGC).
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |