हम व्यापक क्षेत्र के दृश्य निमेटोड ट्रैकिंग मंच (WF-NTP), जो Caenorhabditis एलिगेंसकी बड़ी आबादी के उच्च प्रवाह phenotypic लक्षण वर्णन करता है सक्षम बनाता है का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । इन प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती उपभेदों में या एक उच्च स्केलेबल फैशन में औषधीय उपचार के जवाब में सूक्ष्म व्यवहार परिवर्तन की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Caenorhabditis एलिगेंस जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल है, व्यापक रूप कार्यात्मक जीनोमिक्स और उंर बढ़ने के अध्ययन में कार्यरत । अध्ययन के तहत जानवरों के स्वास्थ्य और फिटनेस का आकलन करने के लिए, एक आम तौर पर शरीर झुकता की संख्या या आंदोलन की गति की माप के रूप में गतिशीलता readouts, पर निर्भर करता है । ये माप आमतौर पर मैनुअल गिनती शामिल है, यह अच्छा सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण बना रही है, समय और श्रम की कमी के रूप में अक्सर 25 या उससे कम के लिए प्रत्येक प्रयोग में पशुओं की संख्या सीमित । उच्च सांख्यिकीय शक्ति के बाद से reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है और झूठी सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम सीमा जब कमजोर phenotypic प्रभाव की जांच कर रहे हैं, प्रयास हाल ही में स्वचालित प्रोटोकॉल को बढ़ाने पर ध्यान केंद्रित विकसित किया गया है गतिशीलता का पता लगाने और बहु-पैरामीट्रिक व्यवहार profiling की संवेदनशीलता। आदेश में छोटे phenotypic परिवर्तन है कि अक्सर आनुवंशिक अध्ययन और दवा की खोज में महत्वपूर्ण है पर कब्जा करने की जरूरत स्तर को पता लगाने की सीमा का विस्तार करने के लिए, हम यहां एक तकनीकी विकास का वर्णन है कि अप करने के लिए ५,००० व्यक्तिगत पशुओं के अध्ययन में सक्षम बनाता है इसके साथ ही, के बारे में १,००० से माप की सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि-मैनुअल परख की तुलना में गुना और के बारे में १०० अंय उपलब्ध स्वचालित तरीकों की तुलना में गुना ।
लगभग आधी सदी पहले, सिडनी ब्रेनर एक मॉडल प्रणाली के रूप में Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) की शुरुआत के विकास और तंत्रिका जीव विज्ञान अध्ययन, इस छोटे (लंबाई में 1 मिमी) के रूप में, पारदर्शी निमेटोड कीड़ा हेरफेर करने के लिए आसान है आनुवंशिक रूप से और1प्रयोगशाला में बनाए रखने के लिए । आज, सी एलिगेंस apoptosis, सेल सिग्नलिंग, कोशिका चक्र की प्रकृति, जीन विनियमन, चयापचय, और उंर बढ़ने सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है2। इसके अलावा, सेलुलर और ऊतक जटिलता, प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न और सी एलिगेंस और उच्च जीवों के बीच रोग रास्ते के संरक्षण (कृमि जीन का ८०% एक मानव orthologue है), सादगी के साथ जुड़ा हुआ है और खेती की लागत प्रभावशीलता, यह एक में प्रभावी बनाने के लिए vivo मॉडल जीव उच्च प्रवाह आनुवंशिक3,4,5,6,7के लिए उत्तरदायी, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , १३ आणि औषध१४,१५,१६ स्क्रिनिंग. इन सभी कारणों के लिए, सी एलिगेंस सामांय और रोग से संबंधित आणविक रास्ते के लक्षण वर्णन के लिए नियोजित किया गया है; neurodegeneration के क्षेत्र में, उदाहरण के लिए, यह प्रोटीन एकत्रीकरण3,4,7,15,17पर वृद्धावस्था के प्रभाव की खोज को सक्षम किया गया है, 18, और प्रोटीन एकत्रीकरण के प्रवर्तकों और अवरोधकों के लक्षण वर्णन3,4,5,6,7,14, 18.
कीड़े के समग्र स्वास्थ्य, जो एक महत्वपूर्ण व्यवहार के लिए अध्ययन के इस प्रकार में परिभाषित किया जा पैरामीटर है, मैंयुअल रूप से विभिंन तरीकों से मापा जा सकता है, जैसे शरीर की संख्या की गिनती द्वारा प्रति मिनट झुकता (BPM)4,6, 19, या आंदोलन की गति को मापने20,21,22, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से औसत उंर और पक्षाघात की दर को मापने के द्वारा । हालांकि शरीर झुकता है और आंदोलन की गति के मैनुअल माप आणविक रास्ते और तंत्र की एक किस्म में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया है3,4,14,19, 20,23, मैनुअल परख वर्तमान में कम प्रवाह, उच्च श्रम गहन, और समय लेने whilst त्रुटियों के लिए प्रवण और मानव पूर्वाग्रहों जा रहा है । इन मुद्दों को पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति के साथ डेटा के संग्रह में काफी चुनौतियों वर्तमान सूक्ष्म व्यवहार परिवर्तन भेद । यह सीमा विशेष रूप से संभावित दवा अणुओं के साथ उपचार के रूप में दवा स्क्रीनिंग के लिए प्रासंगिक है अक्सर छोटे phenotypic परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व24, इसलिए पशुओं की बड़ी संख्या के अध्ययन की आवश्यकता के क्रम में reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए. इस बिंदु को समझाने के लिए, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक उच्च शक्ति का पता लगाने (POD) विश्वास के साथ व्यवहार में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन को परिभाषित करने के लिए और झूठी सकारात्मक परिणामों को सीमित करने के लिए आवश्यक है25। यह सी एलिगेंस समुदाय में एक मजबूत प्रेरणा के परिणामस्वरूप reproducible, स्वचालित, समय और लागत प्रभावी माप के साथ मैनुअल गिनती की जगह है । इस मांग को पूरा करने के लिए, कई प्रयोगशालाओं हाल ही में उच्च संवेदनशीलता माप और कीड़े की बड़ी संख्या के सटीक कीड़ा ट्रैकिंग के लिए तरीके विकसित किया है22,26,27,28 ,29,30,31,३२,३३.
इसके अलावा सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माप के लिए आवश्यक पशुओं के बड़े साथियों को स्वचालन की प्रक्रिया का विस्तार करने के लिए, हम हाल ही में एक विस्तृत क्षेत्र के दृश्य निमेटोड ट्रैकिंग मंच (WF-NTP)15,३४ विकसित किया है ,३५,३६, जो बहुत बड़ी कीड़ा आबादी पर एकाधिक phenotypic readouts की एक साथ जांच सक्षम बनाता है, सांख्यिकीय प्रासंगिक phenotypical पता लगाने में एक महत्वपूर्ण कारक25। न केवल WF-NTP वर्तमान में समानांतर में ५,००० पशुओं के लिए निगरानी कर सकते हैं, लेकिन phenotypic readouts भी कई मापदंडों की दर और शरीर झुकता के आयाम सहित, शामिल हैं, आंदोलन की गति, आबादी है कि झोले के अंश, और जानवरों के आकार । इसलिए यह समानांतर में कीड़े के हजारों स्क्रीन करने के लिए आसानी से संभव है और एक बहुआयामी फिंगरप्रिंट३६बनाने के लिए एक व्यवहार नक्शे में अलग readouts गठबंधन करने के लिए । एसोसिएटेड ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर पायथन में लिखा है, जो भी इसे संचालित करने के लिए आवश्यक है और पूरी तरह से अनुकूलन योग्य है । इस तकनीक को अपनाने के लिए यूजर्स को सक्षम बनाने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI) भी दिया गया है ।
यहां, हम प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला है कि WF-NTP के संभावित अनुप्रयोगों के कुछ वर्णन प्रस्तुत करते हैं । विशेष रूप से, हम यौगिकों के प्रशासन पर चर्चा, छोटे अणुओं से प्रोटीन चिकित्सकीय को लेकर, और वर्णन कैसे कीड़े की बड़ी आबादी पर सीधे उनके प्रभाव स्क्रीन करने के लिए, इस प्रकार प्रभावी रूप से छोटे नमूने की जरूरत को दूर उप आबादी । इस प्रयोजन के लिए WF-NTP का उपयोग पहले से ही अल्जाइमर रोग (AD)15,३४,३५ और पार्किंसंस रोग (पीडी) के ड्रग डिस्कवरी प्रोग्राम डिजाइन करने के उद्देश्य से प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण लाभ लाया है18 चिकित्सकीय उंमीदवारों३५,३७के आकलन के लिए vivo डेटा में प्रयोग ।
क्योंकि ऑप्टिकल विज्ञान के क्षेत्र में तकनीक के तेजी से विस्तार के कारण, यह अब संभव है एलिगेंस अध्ययन में स्वचालित तरीकों के लिए काफी नए तरीके से पते की आवश्यकता है । नतीजतन, डिजिटल ट्रैकिंग प्लेटफार्मों की एक संख्या20,४१,४२,४३,४४,४५,४६ पर डिजाइन किया गया है और उपलब्ध कराया इस तरह के आंदोलन की गति के रूप में मानकों के मैनुअल गिनती की जगह के लिए पिछले कुछ वर्षों में, आवृत्ति झुकने, पक्षाघात दर, और साथ ही व्यवहार के अधिक जटिल रूपों जैसे ओमेगा बदल जाता है, और उम्र माप. सबसे हाल ही में स्वचालित प्लेटफार्मों बहुत reproducibility और सी एलिगेंस अध्ययन के संवेदनशीलता में सुधार हुआ है४१ और छोटे साथियों या यहां तक कि व्यक्तिगत जानवरों पर उच्च गुणवत्ता डेटा प्रदान की है । हम कृमि व्यवहार के विश्लेषण के स्वचालन का विस्तार करने के लिए यह भी समानांतर में पशुओं के हजारों के साथियों के phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए संभव बनाने का फैसला किया । कीड़ा साथियों के अध्ययन के दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि यह कृमि24 व्यवहार के उच्च आंतरिक परिवर्तनशीलता के लिए लेखांकन के लिए अनुमति देता है और तथ्य यह है कि दवा उपचार के अध्ययन अक्सर सूक्ष्म phenotypic रूपांतरों के लिए नेतृत्व के लिए, जो कर रहे है मुश्किल पर्याप्त सांख्यिकीय महत्व के साथ पता लगाने के लिए जब पशुओं के एक छोटे समूह का उपयोग कर । पता लगाने की एक उच्च शक्ति (फली) वास्तव में विश्वास के साथ व्यवहार में किसी भी महत्वपूर्ण भिंनता का पता लगाने के लिए और झूठी सकारात्मक परिणाम25सीमा आवश्यक है ।
यहां, हमने C. एलिगेंसके लिए हाल ही में रिपोर्ट की गई स्वचालित स्क्रीनिंग पद्धति के आधार पर प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला बताई है, जो वाइड फील्ड-ऑफ-व्यू निमेटोड ट्रैकिंग प्लेटफ़ॉर्म (WF-NTP)३६है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल को 5 भागों में विभाजित किया गया है । 1 भागों और 2 बड़े कीड़ा आबादी की तैयारी का वर्णन । महत्वपूर्ण कदम काम की स्थिति और रिएजेंट और आवश्यक प्लेटों की तैयारी के बांझपन के लिए प्रयोग चलाने के लिए कर रहे हैं । हम ध्यान दें कि, वृद्धि हुई अन्य स्क्रीनिंग के तरीके की तुलना में इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान की प्रवाह के कारण३६, यह भी रिएजेंट की मात्रा में वृद्धि की आवश्यकता है; इस पहलू को प्रायोगिक डिजाइन में सावधानीपूर्वक विचार करने की जरूरत है । हम यह भी ध्यान दें कि ब्लीचिंग कदम महत्वपूर्ण है और पहले से परीक्षण की जरूरत है के रूप में अंडे की एक बड़ी संख्या और स्वस्थ लार्वा इन प्रयोगों को चलाने के लिए आवश्यक हैं । इस प्रोटोकॉल विवरण के भाग 3 कैसे ठोस मीडिया और स्क्रीन कीड़ा आबादी में ड्रग्स देने के लिए । हम ध्यान दें कि प्रोटोकॉल के इस भाग के समानांतर में उपयोगकर्ता द्वारा परीक्षण किया जा करने के लिए दवाओं और दवा सांद्रता की संख्या पर दृढ़ता से निर्भर है । स्क्रीनिंग प्रक्रिया का पूरा स्वचालन और तेजी से डेटा अधिग्रहण व्यवहार अवलोकन से सीमित कदम को रिएजेंट तैयारी और विकास और बड़े कीड़ा आबादी के तुल्यकालन बदलाव । व्यवहार स्क्रीनिंग के दौरान महत्वपूर्ण कदम रिकॉर्डिंग के समय और किसी भी कृमि हैंडलिंग कदम (जैसे, NGM प्लेटों से ट्रैकिंग मंच के लिए कीड़े के हस्तांतरण) कर रहे हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक वयस्क उंर के दौरान 9 दिनों तक के लिए कीड़े स्क्रीन डिजाइन उदाहरण है; हालांकि, इस प्रोटोकॉल आसानी से उपयोगकर्ता इच्छाओं के रूप में कई समय अंक के रूप में स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे, 18 लगातार दिन३६। भाग 4 तो प्रोटोकॉल के आवेदन को दिखाता है प्रोटीन अणुओं (जैसे, एंटीबॉडी और आणविक chaperones) सी. एलिगेंसमें उद्धार, और पता चलता है कि कैसे प्रोटोकॉल 1-3 भागों में सचित्र आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, वांछित पर निरभर है अनुप्रयोग. हम प्रदर्शन कैसे इस प्रक्रिया को न केवल दवा की डिलीवरी के अणुओं की तरह है लेकिन यह भी आणविक chaperones या एंटीबॉडी३७के प्रशासन के लिए बढ़ाया जा सकता है । पहले चार कदम (भागों) बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है, जब तक अंयथा उल्लेख किया । सभी तरल घटकों का उपयोग करने से पहले autoclaved होना चाहिए और गर्मी कदम ७०% सापेक्ष आर्द्रता पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । 5 भाग में, हम कैसे सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग मंच के साथ संयोजन में प्रदान की पैकेज का उपयोग करने का वर्णन । यह सॉफ्टवेयर WF-NTP बड़े कीड़ा आबादी के व्यवहार से संबंधित आंकड़ों के विश्लेषण के लिए बनाया गया रिवाज है । हमारा सुझाव है कि उपयोगकर्ता डेटा विश्लेषण के लिए भाग 5 में दिए गए दिशानिर्देशों का पालन करता है; हालांकि, इन मापदंडों रिकॉर्ड वीडियो की विशिष्ट सुविधाओं पर निर्भर कर रहे हैं (यानी, एफपीएस, देखने के क्षेत्र, वीडियो संकल्प, अधिग्रहीत फ्रेम की संख्या). GUI में दिए गए उदाहरण फ़ंक्शन को विश्लेषण से पहले सही मापदंडों के मूल्यांकन की सुविधा देने के लिए डिज़ाइन किया गया है.
प्रोटोकॉल की ये श्रृंखला सी. एलिगेंस की बड़ी आबादी के phenotypes का विश्लेषण करने के लिए संभव बनाने के लिए (वर्तमान में ५,००० व्यक्तिगत कीड़े समानांतर में) प्रभावी ढंग से, कलाकृतियों जानवरों के व्यवहार की आंतरिक परिवर्तनशीलता के कारण को कम करने , एलिगेंस25के अध्ययन के लिए सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए आवश्यक पता लगाने की शक्ति पर प्रारंभिक अध्ययन के साथ समझौते में. मंच उच्च संकल्प कैमरों की एक प्रणाली का उपयोग करता है, एक उच्च गति से पशुओं की बड़ी संख्या की छवियों की रिकॉर्डिंग में सक्षम है, जबकि एक साथ कई बड़े साथियों की रिकॉर्डिंग । उच्च प्रदर्शन और WF-NTP प्रोटोकॉल का उच्च प्रवाह यह एक बहुत ही सटीक तरीके से कृमि व्यवहार में बहुत छोटे परिवर्तन निर्धारित करने के लिए संभव बनाता है । इसलिए, इस पद्धति के नए दृष्टिकोण न केवल एलिगेंस के जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए माना जाता है, लेकिन इसके अलावा औषधीय और चिकित्सा अनुसंधान के लिए, आनुवंशिक संशोधनों और नशीली दवाओं के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के रूप में सक्षम बनाता है उपचार. इस प्रक्रिया को भी पक्षाघात के अध्ययन की अनुमति के अंय व्यवहार मापन, आणविक स्क्रीनिंग अध्ययन में एक महत्वपूर्ण विशेषता के साथ समानांतर में प्रदर्शन करने का लाभ है ।
विज्ञापन15,३४,३५ और पीडी18 की दवा खोज कार्यक्रमों में अब तक हासिल किया गया है कि परिणाम काफी हद तक बढ़ाने में व्यापक क्षेत्र के दृश्य डेटा अधिग्रहण के महत्व का प्रदर्शन जानवरों की संख्या है कि एक ही प्रयोग में नजर रखी जा सकता है, जिससे काफी प्रयोगात्मक त्रुटियों को कम करने और बहुत अध्ययन के सांख्यिकीय वैधता में सुधार । जबकि वर्तमान दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल में वर्णित दवा की खोज के क्षेत्र में चुनौतियों को संबोधित करने पर ध्यान केंद्रित किया है, हमें उंमीद है कि इस पद्धति को व्यापक रूप से समुदाय में अपनाया जाएगा, और है कि अपने आवेदन जटिल आनुवंशिक करने के लिए बढ़ाया जाएगा और व्यवहार अध्ययन और वर्तमान में जासूसी कर रहे हैं कि phenotypes की संख्या का विस्तार.
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य के लिए केंद्र द्वारा रोगों का खुलासा (सीएमडी) का समर्थन किया गया । FAA अल्जाइमर सोसायटी, ब्रिटेन (अनुदान संख्या ३१७, के रूप में-एस एफ-16-003) से एक वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप पुरस्कार द्वारा समर्थित है । सी. एलिगेंस उपभेदों को Caenorhabditis एलिगेंस जेनेटिक सेंटर (CGC) से प्राप्त किया गया.
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |