qKAT : quantitatif semi-Automated typage des cellules tueuses-gènes de récepteurs immunoglobuline-like

Summary

Quantitative des cellules tueuses récepteur immunoglobuline-like (KIR) saisie semi-automatique (qKAT) est une méthode simple, haut-débit et rentable pour copier le numéros gènes de type KIR pour leur application dans les études d’association de la population et de la maladie.

Abstract

Récepteurs de cellules tueuses immunoglobuline-like (RIC) sont un ensemble de récepteurs immunitaires inhibitrices et activation, tueuses naturelles (NK) et de lymphocytes T, codées par un cluster polymorphe des gènes sur le chromosome 19. Leurs ligands mieux caractérisés sont les molécules d’antigen (HLA) de leucocytes humains qui sont codés dans le locus (MHC) complexe majeur d’histocompatibilité sur le chromosome 6. Il y a des preuves substantielles qu’ils jouent un rôle important dans l’immunité, la reproduction et la transplantation, rend crucial d’avoir des techniques qui peuvent précisément génotype eux. Cependant, haute-homologie, aussi bien qu’allélique et variation numéro de copie, rendent difficile de génotype et efficacement les méthodes de conception qui peuvent avec précision tous les gènes KIR . Les méthodes traditionnelles sont généralement limitées dans la résolution des données obtenues, débit, la rentabilité et le temps nécessaire à la mise en place et d’exploiter les expériences. Les auteurs décrivent une méthode appelée quantitative KIR saisie semi-automatique (qKAT), qui est une méthode de PCR multiplex Real-Time polymerase haut débit qui permet de déterminer le nombre de copies du gène pour tous les gènes dans le locus KIR . qKAT est une méthode simple de haut débit qui peut fournir des données à haute résolution KIR copie numéros, qui permet plus d’en déduire les variations dans les haplotypes structurellement polymorphes qui englobent les. Ces données de nombre et haplotype de copie peuvent être bénéfiques pour les études sur les associations de maladies à grande échelle, la génétique des populations, ainsi que les enquêtes sur l’expression et les interactions fonctionnelles entre KIR et HLA.

Introduction

Chez l’homme, le tueur récepteur immunoglobuline-like(KIR) locus est localisé sur le bras long du chromosome 19 dans le complexe de récepteur de leucocyte (LRC). Ce locus est d’environ 150 Ko de long et comprend 15 KIR gènes disposées tête à queue. Les locus KIR qui sont actuellement connues sont KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, et deux pseudogènes, KIR2DP1 et KIR3DP1. KIR gènes codent pour deux dimensions (2D) et tridimensionnels (3D) domaine d’immunoglobuline-like récepteurs avec short (S ; activation) ou long (L ; inhibitrice) pastilles cytoplasmique, qui sont exprimés par les cellules tueuses naturelles (NK) et de sous-ensembles de T cellules. Copie variation numéro exposé dans les formes de locus KIR différents haplotypes avec gène variable contenu¹. Recombinaison homologue non-alléliques (NAHR), facilitée par un arrangement de gène de tête-à-queue étroite et haute-homologie, est le mécanisme proposé d’être responsable pour la variabilité haplotypique. Plus de 100 différents haplotypes ont été signalés dans les populations dans le monde^1,2,3,4. Tous ces haplotypes pourrait être divisées en deux grands groupes : les haplotypes A et B. L’haplotype A contient 7 gènes KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1et KIR3DL2, qui sont des gènes inhibiteurs de KIR et l’activation KIR gène KIR2DS4. Cependant, jusqu'à 70 % de personnes d’origine européenne qui sont homozygotes pour KIR haplotype A exclusivement effectuer une forme non fonctionnelle « suppression » de KIR2DS4^5,6. Toutes les autres combinaisons de gènes KIR forment d’haplotypes du groupe B, dont au moins un des gènes spécifiques KIR KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, et KIR2DL5et comprennent généralement deux ou plusieurs gènes KIR activant.

Molécules HLA classe I ont été identifiés comme les ligands pour certains récepteurs inhibiteurs (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3et KIR3DL1), activant les récepteurs (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5et KIR3DS1), et pour KIR2DL4, qui est un unique KIR qui contient un long cytoplasmique queues comme autres récepteurs inhibiteurs de KIR, mais dispose également d’un résidu chargé positivement près le domaine extracellulaire qui est un commun fonction d’autres récepteurs KIR activant. La combinaison des variantes dans les gènes KIR et les gènes HLA influence interaction ligand du récepteur cette réactivité de cellules NK potentielle de formes au niveau individuel^7,8. Preuves provenant d’études de liaison génétique a indiqué que le KIR joue un rôle dans la résistance virale (par exemple., le virus d’immunodéficience humaine [VIH]⁹ et l’hépatite C [VHC]¹⁰), le succès de la greffe ¹¹, le risque de troubles de la grossesse et le succès reproducteur^12,13, la protection contre les rechutes après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) la transplantation^{14,15, 16}et le risque de cancers¹⁷.

La combinaison d’homologie de séquence haute et alléliques et haplotypiques diversité présente défis dans la tâche de façon précise les gènes KIR génotypage. Les méthodes conventionnelles de type KIR gènes comprennent amorce séquence-spécifique (SSP) polymerase chain reaction (PCR)^18,19,20, séquence spécifique oligonucléotide sonde PCR (SSOP)²¹, et laser assistée matrice desorption ionisation et l’heure de vol de spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS)²². Les inconvénients de ces techniques sont qu’ils fournissent seulement partiel aperçu le génotype d’un individu tout en étant aussi laborieux à effectuer. Récemment le séquençage de prochaine génération (NGS) a été appliqué pour taper le locus KIR spécifiquement. Alors que cette méthode est très puissante, il peut être coûteux à exécuter, et c’est beaucoup de temps mener des contrôles approfondis de données et d’analyse.

qKAT est une méthode PCR quantitative de haut débit. Alors que les méthodes conventionnelles sont laborieux et fastidieux, cette méthode permet d’exécuter presque 1 000 échantillons d’ADN (génomique) génomiques en cinq jours et donne le génotype KIR , ainsi que le nombre de copies du gène. qKAT se compose de dix réactions multiplexes, dont chacun vise deux loci KIR et un gène de référence d’un nombre de copie fixée dans le génome (STAT6) utilisé pour la quantification relative du gène KIR copier le numéro²³. Ce test a été utilisé avec succès dans les études portant sur les panneaux de la grande population et cohortes de la maladie sur les maladies infectieuses comme le VHC, des maladies auto-immunes comme le diabète de type 1 et des troubles de la grossesse comme la pré-éclampsie, ainsi que fournir une génétique base à des études visant à comprendre les NK cell function^1,4,24,25,26.

Protocol

1. préparation et électrodéposition d’ADN

1. Quantifier précisément la concentration de génomique à l’aide d’un instrument spectrophotométrique ou fluorimétrique.
2. Diluer l’ADN à 4 ng/µL sur une plaque de 96 puits puits profonds. Inclure au moins un échantillon d’Adng de contrôle avec un nombre de copies connues et un contrôle sans modèle.
3. Centrifuger les plaques 96 puits à 450 x g pendant 2 min.
4. À l’aide d’un instrument de manipulation de liquides, répartir chaque échantillon en quatre exemplaires sur plaques 384 puits qPCR afin que chaque cupule a 10 ng d’ADN (2,5 µL/puits). Préparer au moins dix plaques 384 puits, un pour chaque réaction de qKAT.
5. Si Adng est actuellement distribué depuis plus d’une plaque à 96 puits, effectuer un lavage de volume complet avec 2 % eau de Javel et eau ultrapure pour nettoyer les aiguilles du liquide système entre chaque plaque à 96 puits d’échantillons Adng de manutention.
6. Sécher à l’air l’ADN en incubant les plaques 384 puits dans un endroit propre à température ambiante pendant au moins 24 h.

2. préparation des amorces et des sondes

Remarque : qKAT se compose de dix réactions multiplexes. Chaque réaction comprend trois paires d’amorces et de trois sondes marquées fluorescence qui amplifient spécifiquement deux gènes KIR et gène une seule référence. Les sondes qui ont été publiés dans Jiang et al.,²⁷ ont été modifiés afin que les oligonucléotides sont maintenant marqués avec ATTO colorants car ils offrent photostabilité améliorée et longues durées de vie. Pré-aliquotés d’amorces sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières).

1. Préparer des paires d’amorces pour chaque réaction selon les dilutions indiquées au tableau 1.
2. Préparer les combinaisons de sonde pour chaque réaction conformément au tableau 1. Chaque sonde individuel avant de faire la combinaison de contrôle.

3. préparation du Mix Master

NOTE Les volumes mentionnés ci-dessous sont pour effectuer une réaction de qKAT sur un ensemble de plaques de 10 x 384 puits.

1. S’assurer que les échantillons d’Adng plaqués sur les plaques 384 puits soient complètement secs. Procéder à toutes les étapes sur la glace et garder les réactifs couverts contre l’exposition à la lumière autant que possible, puisque les sondes marquées fluorescence sont photosensibles et thermo.
2. Décongeler le tampon de qPCR, apprêt et sonde aliquotes à 4 ° C.
3. Sur la glace, préparer un mélange maître pour plaques de 10 x 384 puits en ajoutant 18,86 mL d’eau ultrapure, 20 mL de tampon de qPCR et 1 000 µL de combinaison d’amorces des 180 µL de combinaison des sonde (tableau 2).
4. Répartir le mélange maître à travers une plaque de profondeur 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux, pipetage 415 µL à chaque puits. Garder cette plaque dans une glacière couverte de la lumière.
5. À l’aide d’un instrument de manipulation de liquides, distribuer 9,5 µL du mélange maître dans chaque puits de la plaque 384 puits avec Adng séchée. Sceller la plaque avec une feuille et le placer immédiatement à 4 ° C. Répétez ce processus pour les plaques restantes, veiller à ce que les aiguilles du liquide système de manutention sont lavés avec de l’eau entre chaque plaque.
6. Centrifuger les plaques 384 puits à 450 x g pendant 3 min et les incuber à 4 ° C durant la nuit ou entre 6 à 12 h pour remettre en suspension l’ADN et à dissiper les bulles d’air.

4. qPCR Assay

1. Après l’incubation durant la nuit, centrifuger à 450 g pendant 3 min dissiper les bulles d’air restantes.
2. Aux fins de l’automatisation, brancher la machine de qPCR (p. ex., LightCycler 480) à un gestionnaire de la microplaque (voir Table des matières). Programme gestionnaire microplaque afin de placer les plaques dans la machine de qPCR partir d’un quai de stockage refroidi abri de la lumière.
   NOTE les essais devraient, en théorie, travailler sur d’autres machines de qPCR avec paramètres optiques compatibles.
3. Utiliser les conditions suivantes de cyclisme : 95 ° C pendant 5 min, suivi de 40 cycles de 95 ° C pour 15 s et 66 ° C pendant 50 s, avec la collecte de données à 66 ° C.
4. Une fois que la série est terminée, avoir le robot recueillir la plaque de la machine de qPCR et placez-le dans le dock de défausse.

5. après l’exécution de l’analyse

1. Après amplification, calculer les valeurs de cycle (Cq) quantification à l’aide de la méthode maximale dérivée seconde ou la méthode des Points de lissage avec le logiciel de la machine de qPCR (voir Table des matières), suivant les étapes ci-dessous.
2. Ouvrez le logiciel de qPCR et, dans l’onglet navigateur , ouvrez le fichier d’expérience de réaction enregistrée pour une plaque.
3. Pour l’analyse en utilisant la méthode maximale dérivée seconde, sélectionnez l’onglet analyse et de créer une nouvelle analyse à l’aide de la méthode Abs Quant/Second dérivé du Max.
   1. Dans la fenêtre Créer nouvelle analyse , sélectionnez le type d’analyse : méthode Abs Quant/Second dérivé du Max, sous-ensemble : tous les échantillons, programme : Amplification, nom : Rx-MPO (où x est le nombre de réaction).
   2. Sélectionnez Filtre peigne et choisissez VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Cela garantit que les données recueillies pour STAT6 sont sélectionnées.
   3. Sélectionnez couleur Compensation pour VIC/HEX/Yellow555(533-580). Cliquez sur calculer. Répétez cette opération pour Fam (465-510) et Cy5/Cy5.5(618-660). Cliquez sur enregistrer le fichier.
4. Pour l’analyse à l’aide de la méthode d’ajustement Points, sélectionnez Abs Quant/Fit Points dans l’onglet analyse.
   1. Dans la fenêtre Créer nouvelle analyse , sélectionnez le type d’analyse : méthode Abs Quant/Fit Points, sous-ensemble : tous les échantillons, programme : Amplification, nom : RxF-MPO (où x est le nombre de réaction).
   2. Sélectionnez les filtres corrects et les compensations de couleur pour STAT6 et chacun des gènes KIR (Fam/Cy5). Dans l’onglet Noiseband , sélectionner la bande de bruit d’exclure le bruit de fond.
   3. Dans l’onglet analyse , la valeur des points de lissage 3 et sélectionnez que show points de lissage. Cliquez sur calculer. Cliquez sur enregistrer le fichier.

6. l’exportation des résultats

1. Dans le logiciel de qPCR, ouvrez le navigateur onglet sélectionnez Résultats Batch Export.
2. Ouvrez le dossier dans lequel les fichiers de l’expérience sont enregistrés et transférer les fichiers dans la section droite de la fenêtre. Cliquez sur suivant. Sélectionnez le nom et l’emplacement du fichier d’exportation.
3. Sélectionnez le type d’analyse méthode Abs Quant/Second dérivé du Max ou Abs Quant/Fit Points. Cliquez sur suivant. Vérifiez que le nom du fichier, le dossier d’exportation et le type d’analyse sont correct et cliquez sur suivant pour démarrer le processus d’exportation.
4. Attendez que l' État d’exportation est Ok. L’écran passera automatiquement à l’étape suivante. Vérifiez que tous les fichiers sélectionnés ont été exportés avec succès pour que le nombre de fichiers a échoué = 0. Cliquez sur terminé.
5. Utiliser les scripts split_file.pl et roche2sds.pl pour couper les plaques exportés en réactions individuelles pour chaque plaque.
   NOTE les scripts sont fournis sur demande/GitHub.

7. copiez le numéro de calculs

1. Ouvrez le logiciel d’analyse numéro copie (par exemple, CopyCaller). Sélectionnez importer fichier de résultats de PCR en temps réel et charger des fichiers texte créés par roche2sds.pl.
2. Sélectionnez analyser et procéder à l’analyse de chaque sélection échantillon étalon avec nombre de copie connue ou en sélectionnant le numéro de copie plus fréquent. Voir tableau 5 pour le nombre de copies plus fréquent des gènes KIR généralement observées dans les populations d’origine européenne.

8. qualité des données vérifie

1. Utilisez le script R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R de combiner des données de numéros de copie de toutes les plaques dans un tableur.
   NOTE les scripts sont fournis sur demande/GitHub.
2. Revérifier les données brutes sur le logiciel d’analyse numéro de copie pour les échantillons qui ne respectent pas le déséquilibre de liaison connue (LD) pour KIR gènes (tableau 6).

Results

Analyse numéro copie peut être effectuée en exportant les fichiers dans le logiciel d’analyse numéro de copie, qui fournit le nombre de copies prédites et estimée selon la méthode de ΔΔCq.

On peut prédire le nombre de copies que soit basée sur le nombre de copie connue contrôle d’échantillons d’ADN sur la plaque ou en entrant le nombre de copies de gènes plus fréquent (tableau 5). La figure 1 montre les résultats d’une plaque pour une réaction qui cible KIR2DL4 et KIR3DS1, ainsi que le gène de référence STAT6. Le nombre de copies plus fréquent pour KIR2DL4, un gène de cadre dans le locus KIR , est deux copies, alors que le nombre de copies plus fréquent pour KIR3DS1, un gène activant, est une copie. Les résultats de la figure montrent les parcelles d’amplification PCR observées sur le logiciel de qPCR et les données de numéro de copie générées à partir des données de qPCR. Comme indiqué, le test est capable de distinguer entre 0, 1, 2, 3 et 4 nombre de copies de gènes KIR . Le logiciel d’analyse numéro de copie permet aussi une visualisation de la distribution du nombre de copies à travers la plaque comme un graphique en secteurs ou un graphique à barres. L’efficacité de la prédiction de nombre de copie est plus faible pour les échantillons ayant un plus grand nombre de copie.

La qualité de tous les matériaux utilisés dans les réactions Adng, tampon, amorces et sondes, peut affecter la précision des résultats obtenus. Toutefois, une discordance dans les résultats est plus susceptible d’être causé par une variation de la concentration de l’ADN sur une plaque. La pureté de l’Adng extrait, qui peut être mesurée à l’aide de la 260/280 et 260/230 rapports, peut aussi avoir un effet sur la qualité. Un ratio 260/280 du ratio 1,8-2 et 260/230 du 2-2. 2 sont souhaitables. Une concentration de portée inégale de l’ADN à travers une plaque peut conduire à une forte variabilité du cycle seuil (C_t) entre les échantillons et une discordance dans la gamme du nombre estimé de copies. Les résultats de la Figure 2 montrent l’effet de que la disparité entre les valeurs de_t C sur une plaque peut avoir sur l’exactitude dans la prédiction du nombre de copies. La ligne rouge indique la fourchette du nombre estimé de copies pour un échantillon et, idéalement, devrait être aussi proche d’un entier que possible.

Les données de numéro de copie, une fois analysées, peuvent être exportées dans un fichier de feuille de calcul dans un format de 96 puits. Nous avons utilisé un script R (disponible sur demande) pour combiner les données de numéro de copie de toutes les 10 plaques qui fonctionnent comme un ensemble dans un tableur. Les données publiées sur KIRs provenant pour la plupart des populations d’origine européenne permettent la prédiction des règles LD qui existent entre différents gènes dans le complexe de KIR ¹. Ces prédictions sont utilisées pour effectuer des vérifications en aval sur l’exemplaire numéro résultats obtenus (tableau 6). Les échantillons qui ne sont pas conforment à la LD prévu entre les gènes pourraient contenir polymorphisme inhabituelle ou haplotypique variations structurales. Un organigramme décrivant le protocole est illustré à la Figure 3.

Un outil appelé identificateur de Haplotype KIR (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) a été développé afin de faciliter l’imputation des haplotypes de l’ensemble de données. L’imputation fonctionne sur la base d’une liste de référence haplotypes observés dans une population d’origine européenne¹. Toutefois, l’outil permet également pour un jeu personnalisé des haplotypes de référence à utiliser à la place. Trois dossiers distincts sont produisent ; le premier fichier répertorie toutes les combinaisons de haplotype pour obtenir un exemple, le deuxième fichier fournit une liste ajustée des combinaisons haplotypes disposant des plus hautes fréquences combinées et le troisième fichier répertorie les exemples qu’il ne peut pas être assignés des haplotypes. Non autorisation de cession des haplotypes pourrait servir d’indicateur des haplotypes roman.

Figure 1 : résultats représentatifs d’une plaque pour la réaction numéro 5. (A), ce panneau affiche amplification parcelles. (B), ce panneau affiche copie nombre emplacements. (C), ce panneau montre la distribution de nombre de copie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : résultats représentatifs d’une plaque avec une concentration d’ADN variable pour la réaction numéro 5. (A), ce panneau affiche amplification parcelles. (B), ce panneau affiche copie nombre emplacements. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : diagramme de flux du protocole qKAT. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Test	Gènes	Amorces avant	Concentration (nM)	Inverser les amorces	Concentration (nM)	Sondes	Concentration (nM)
N ° 1	3DP1	A4F	250	A5R	250	P4a	150
	2DL 2	2DL2F4	400	C3R2	600	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N° 2	2DS2	A4F	400	A6R	400	P4a	200
	2DL 3	D1F	400	D1R	400	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N° 3	3DL 3	A8F	500	A8R	500	P4a	150
	2DS4Del	2DS4Del	250	2DS4R2	250	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N° 4	3DL1e4	B1F	250	B1R	125	P4b	150
	3DL1e9	D4F	250	D4R2	500	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N° 5	3DS1	B2F	250	B1R	250	P4b	150
	2DL 4	C1F	200	C1R	200	P5B - 2DL 4	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N° 6	2DL 1	B3F	500	B3R	125	P4b	150
	2DP1	D3F	250	D3R	500	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N° 7	2DS1	B4F	500	B4R	250	P4b	150
	2DL 5	D2F	500	D2R	500	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N° 8	2DS3	B5F	250	B5R	250	P4b	150
	3DL2e9	D4F	250	D5R	125	P9	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N° 9	3DL2e4	A1F	200	A1R	200	P4a	150
	2DS4FL	2DS4FL	250	2DS4R2	500	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
N° 10	2DS5	B6F2	200	B6R3	200	P4b	150
	2DS4	C5F	250	C5R	250	P5B	150
	STAT6	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150

Tableau 1 : combinaison et concentration des amorces et des sondes utilisées dans chaque réaction de qKAT ²⁷ .

Réaction					Apprêt aliquotes (µL)				Sonde aliquotes (µL)
R1	3DP1	A4F	A5R	2DL2F4	C3R2	EAU	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DL 2	100	100	160	240	200	80	80	60	60	60
R2	2DS2	A2F	A6R	D1F	D1R	EAU	STAT6F	STAT6R	P4A	P9	PSTAT6
	2DL 3	160	160	160	160	160	80	80	80	60	60
									Remarque : besoin 20 µL moins d’eau dans le MasterMix
R3	3DL 3	A8F A8FB	A8R	2DS4DELF	2DS4R2	EAU	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4DEL	100 100	200	100	100	200	80	80	60	60	60
R4	3DL1E4	B1F	B1R	D4F	D4R2	EAU	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL1E9	100	50	100	200	350	80	80	60	60	60
R5	3DS1	B2F	B1R	C1F	C1R	EAU	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B - 2L 4	PSTAT6
	2DL 4	100	100	80	80	440	80	80	60	60	60
R6	2DL 1	B3F	B3R	D3F	D3R	EAU	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DP1	200	50	100	200	250	80	80	60	60	60
R7	2DS1	B4F	B4R	D2F	D2R	EAU	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DL 5	200	100	200	200	100	80	80	60	60	60
R8	2DS3	B5F	B5R	D4F	D5R	EAU	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL2E9	100	100	100	50	450	80	80	60	60	60
R9	3DL2E4	A1F	A1R	2DS4WTF	2DS4R2	EAU	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4WT	80	80	100	200	340	80	80	60	60	60
R10	2DS5	B6F2	B6R3	C5F	C5R	EAU	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B	PSTAT6
	2DS4TOTAL	80	80	100	100	440	80	80	60	60	60

Tableau 2 : Volumes (µL) de 100 µM amorce/sonde des solutions mères de faire primer et sonder les aliquotes de combinaison.

Nom	Direction	modification de 5´	modification de 3´	Séquence (5' →3')	Longueur	TM	% GC	Exon	Position
P4a	Sens	FAM	BHQ-1	TCATCCTGC AATGTTGGT CAGATGTCA	27	60	44,4	4	425-451
P4b	Antisens	FAM	BHQ-1	AACAGAACC GTAGCATCT GTAGGTCCC T	28	62	50	4	576-603
P5B	Sens	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TTCCTCTG	25	60	52	5	828-852
P5B - 2DL 4	Sens	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TCCCTCTG	25	61	56	5	828-852
P9	Sens	ATTO647N	BHQ-2	CCCTTCTCA GAGGCCCA AGACACC	24	60	62,5	9	1246-1269
PSTAT6		ATTO550	BHQ-2	CTGATTCCT CCATGAGCA TGCAGCTT	26	62	50

Tableau 3 : liste des sondes utilisées en qKAT ^{1, 27}. les colorants fluorescents utilisés à l’extrémité 5' des sondes oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9 et PSTAT6 ont été modifiés aux colorants ATTO.

Gène	Amorces	Direction	Séquence (5´-3´)		Longueur	TM	% GC	Exon	Position	Amplicon (bp)	Allèles peuvent être manqués
3DL2e4	A1F	Vers l’avant	GCCCCTGCTGAA ATCAGG		18	52	61.1	4	399-416	179	3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
	A1R	Marche arrière	CTGCAAGGACAG GCATCAA		19	53	52,6		559-577		3DL 2 * 048
3DP1	A4F	Vers l’avant	GTCCCCTGGTGA AATCAGA		19	49	52,6	4	398-416	112	Aucun
	A5R	Marche arrière	GTGAGGCGCAAA GTGTCA		18	52	55,6		492-509		Aucun
2DS2	A2F	Vers l’avant	GTCGCCTGGTGA AATCAGA		19	49	52,6	4	398-416	111	Aucun
	A6R	Marche arrière	TGAGGTGCAAAG TGTCCTTAT		21	51	42,9		488-508		Aucun
3DL 3	A8Fa	Vers l’avant	GTGAAATCGGGA GAGACG		18	50	55,6	4	406-423	139	Aucun
	A8Fb	Vers l’avant	GGTGAAATCAGG AGAGACG		19	50	52,6		405-423		3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
	A8R	Marche arrière	AGTTGACCTGGG AACCCG		18	51	61.1		526-543		Aucun
3DL1e4	B1F	Vers l’avant	CATCGGTCCCAT GATGCT		18	51	55,6	4	549-566	85	3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
	B1R	Marche arrière	GGGAGCTGACAA CTGATAGG		20	52	55		614-633		3DL 1 * 00502
3DS1	B2F	Vers l’avant	CATCGGTTCCAT GATGCG		18	51	55,6	4	549-566	85	3DS1 * 047 ; peuvent se procurer 3DL 1 * 054.
	B1R	Marche arrière	GGGAGCTGACAA CTGATAGG		20	52	55		614-633		Aucun
2DL 1	B3F	Vers l’avant	TTCTCCATCAGT CGCATGAC		20	52	50	4	544-563	96	2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
	B3R	Marche arrière	GTCACTGGGAGC TGACAC		18	50	61.1		622-639		2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1	B4F	Vers l’avant	TCTCCATCAGTC GCATGAA		19	51	47,4	4	545-563	96	2DS1 * 001
	B4R	Marche arrière	GGTCACTGGGAG CTGAC		17	49	64,7		624-640		Aucun
2DS3	B5F	Vers l’avant	CTCCATCGGTCG CATGAG		18	53	61.1	4	546-563	96	Aucun
	B5R	Marche arrière	GGGTCACTGGGA GCTGAA		18	51	61.1		624-641		Aucun
2DS5	B6F2	Vers l’avant	AGAGAGGGGACG TTTAACC		19	50	52,6	4	475-493	173	Aucun
	B6R3	Marche arrière	TCCAGAGGGTCA CTGGGC		18	53	66,7		630-647		2DS5 * 003
2DL 4	C1F	Vers l’avant	GCAGTGCCCAGC ATCAAT		18	52	55,6	5	808-825	83	Aucun
	C1R	Marche arrière	CCGAAGCATCTG TAGGTCT		19	52	52,6		872-890		2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2	2DL2F4	Vers l’avant	GAGGTGGAGGCC CATGAAT		19	52	57,9	5	778-796	151	2DL 2 * 009 ; 782G changé à A.
	C3R2	Marche arrière	TCGAGTTTGACC ACTCGTAT		20	51	45		909-928		Aucun
2DS4	C5F	Vers l’avant	TCCCTGCAGTGC GCAGC		17	57	70.6	5	803-819	120	Aucun
	C5R	Marche arrière	TTGACCACTCGT AGGGAGC		19	52	57,9		904-922		2DS4 * 013
2DS4Del	2DS4Del	Vers l’avant	CCTTGTCCTGCA GCTCCAT		19	54	57,9	5	750-768	203	Aucun
	2DS4R2	Marche arrière	TGACGGAAACAA GCAGTGGA		20	53	50		933-952		Aucun
2DS4FL	2DS4FL	Vers l’avant	CCGGAGCTCCTA TGACATG		19	53	57,9	5	744-762	209	Aucun
	2DS4R2	Marche arrière	TGACGGAAACAA GCAGTGGA		20	53	50		933-952		Aucun
2DL 3	D1F	Vers l’avant	AGACCCTCAGGA GGTGA		17	48	58,8	9	1180-1196	156	Aucun
	D1R	Marche arrière	CAGGAGACAACT TTGGATCA		20	50	45		1316-1335		2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 et 2DL 3 * 01802
2DL 5	D2F	Vers l’avant	CACTGCGTTTTC ACACAGAC		20	52	50	9	1214-1233	120	2DL5B * 011 et 2DL5B * 020
	D2R	Marche arrière	GGCAGGAGACAA TGATCTT		19	49	47,4		1315-1333		Aucun
2DP1	D3F	Vers l’avant	CCTCAGGAGGTG ACATACGT		20	53	55	9	1184-1203	121	Aucun
	D3R	Marche arrière	TTGGAAGTTCCG TGTACACT		20	50	45		1285-1304		Aucun
3DL1e9	D4F	Vers l’avant	CACAGTTGGATC ACTGCGT		19	52	52,6	9	1203-1221	93	3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
	D4R2	Marche arrière	CCGTGTACAAGA TGGTATCTGTA		23	53	43,5		1273-1295		3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9	D4F	Vers l’avant	CACAGTTGGATC ACTGCGT		19	52	52,6	9	1203-1221	156	Aucun
	D5R	Marche arrière	GACCTGACTGTG GTGCTCG		19	54	63,2		1340-1358		Aucun
STAT6	STAT6F	Vers l’avant	CCAGATGCCTAC CATGGTGC		20	54	60			129
	STAT6R	Marche arrière	CCATCTGCACAG ACCACTCC		20	54	60

Tableau 4 : les séquences des amorces utilisées dans qKAT ^{1, 27}.

KIR gène		3DL 3	2DS2	2DL 2	2DL 3	2DP1	2DL 1	3DP1	2DL 4	3DL 1 EX9	3DL 1 EX9	3DS1	2DL 5	2DS3	2DS5	2DS1	2DS4 Total	2DS4 FL	2DS4 DEL	3DL 2 EX4	3DL 2 EX9
Nombre de copies plus fréquent		2	1	1	2	2	2	2	2	2	2	1	1	1	1	1	2	1	1	2	2

Tableau 5 : Nombre de copies plus fréquent pour KIR gènes couramment observés dans les échantillons d’origine européenne.

	Règles de déséquilibre d’assemblage pour qKAT issu des populations européennes				Vérification de numéro de copie
1	KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 et KIR3DL2 sont des gènes de cadre présents sur les deux haplotypes.				KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 et KIR3DL2 = 2
2	KIR2DS2 et KIR2DL2 sont en LD entre eux				2DS2=2 DL 2
3	KIR2DL2 et KIR2DL3 sont des allèles du même gène				2 DL 2+2 DL 3= 2
4	KIR2DP1 et KIR2DL1 sont en LD entre eux				2DP1=2 DL 1
5	Exon 4 du KIR3DL1 et KIR3DL2 est égal à exon 9 de KIR3DL1 et KIR3DL2 respectivement.				3DL1ex4=3DL1ex9 et 3DL2ex4=3DL2ex9
6	KIR3DL1 et KIR3DS1 sont des allèles				3 DL 1+3DS1= 2
7	KIR2DS3 et KIR2DS5 sont en LD avec KIR2DL5				2DS3+2DS5=2 DL 5
8	KIR3DS1 et KIR2DS1 sont en LD				3DS1=2DS1
9	Présence d’otal KIR2DS1 et KIR2DS4Test mutuellement exclusive sur un haplotype				2DS1+2DS4TOTAL= 2
10	KIR2DS4FL et KIR2DS4del sont des variantes du KIR2DS4TOTAL				2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tableau 6 : déséquilibre de liaison entre KIR gènes couramment observés dans les populations d’origine européenne peuvent être utilisés pour vérifier les données de numéros de copie ^1,27.

Discussion

Nous avons décrit une nouvelle méthode semi-automatisée haut-débit, appelée qKAT, ce qui facilite la copie numéro typage des gènes KIR . La méthode est une amélioration par rapport aux méthodes conventionnelles comme fournisseur de services partagés-PCR, qui sont de faible débit et peut seulement indiquer la présence ou l’absence de ces gènes très polymorphes.

L’exactitude des données numéros copie obtenues dépend de multiples facteurs, y compris la qualité et la concentration-homogénéité des échantillons Adng et la qualité des réactifs. La qualité et la précision des échantillons Adng à travers une plaque sont extrêmement importantes car les variations de concentration à travers la plaque peuvent entraîner des erreurs dans le calcul du nombre de copie. Étant donné que les tests ont été validés à l’aide des ensembles d’échantillons origine européenne, données de cohortes provenant d’autres parties du monde exigent des vérifications plus approfondies. Il s’agit de faire en sorte que les instances de décrochage de l’allèle ou liaison non-spécifique apprêt/sonde ne sont pas interprété à tort comme variation numéro de copie.

Alors que les tests ont été conçus et optimisés pour exécuter en tant que haut-débit, ils peuvent être modifiés pour exécuter moins d’échantillons. La métrique de confiance dans le logiciel d’analyse numéro de copie est affectée lors de l’analyse des échantillons de moins, mais cela peut être améliorée si les échantillons d’ADN génomiques contrôle avec un nombre connu de la copie du gène KIR figurent sur la plaque et répétitions d’échantillonnage supplémentaires sont inclus.

Pour les laboratoires sans liquide/plaque-manutention robots, mélange principal peut être dispensée à l’aide de pipettes multicanaux et plaques peuvent être chargés manuellement dans l’instrument de qPCR.

L’objectif principal derrière le développement de qKAT devait créer une méthode simple, de haut débit, haute résolution et rentable au génotype KIRs pour maladie études d’association. Ceci a été réalisé avec succès puisque qKAT a été employé dans l’enquête sur le rôle de KIR dans plusieurs études d’association de grandes maladies, y compris une gamme de maladies infectieuses, maladies auto-immunes et grossesse troubles^{4, 24 , 25 , 26}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FORTSCLÉOTIDES
	FORTS Sigma	Ordre personnalisé	SÉQUENCES : Répertorié dans le Tableau 4
Sondes étiquetées avec les colorants ATTO	Sigma	Ordre personnalisé	SÉQUENCES : Répertorié dans le Tableau 3
Sonde SensiFAST Kit No-ROX	Bioline	BIO-86020	&minus ;
MilliQ eau	&moins ;	&minus ;	&minus ;
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
EQUIPMENT
Centrifugeuse avec rotor à godets oscillants	Eppendorf(ou équivalent)	Eppendorf 5810R ou système
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
OR
QuBit Fluoromètre	Life Technologies	Q33216
Matrice Hydra	Thermo Scientific	109611
LightCycler 480 II Instrument 384 puits	Roche	05015243001
Twister II Microplate Handler avec Mé ; Empileur de plaques thermique Cour (Mé ; Cour)	Caliper Life Sciences	204135
Mélangeur Vortex	Biosan	BS-010201-AAA
Pipettes monocanaux (plage de volume : 0,5 &ndash ; 10 et micro ; L, 2&ndash ; 20 et micro ; L, 20&ndash ; 200 et micro ; L, 200&ndash ; 1 000 et micro ; L; 1-10 mL)	Gilson(ou équivalent)	F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
pointes de pipette sans RNase et DNase filtrées (10 & micro ; L, 20 et micro ; L, 200 et micro ; L, 1 000 et micro ; L, 10 mL)	Starlab (ou équivalent)	S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
Réservoir de réactifs StarTub PS, 55 mL	STARLAB	E2310-1010
Tube à centrifuger de 50 mL	STARLAB	E1450-0200
Plaque pour puits profonds à 96 puits	Fisher Scientific	12194162
LC480 384 Plaques multipuits	Roche	04729749001
Feuille d’étanchéité LightCycler 480	Roche	04729757001
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1			https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
l’identifiant			d’haplotype