양적 살인자 세포 수용 체 면역 글로불린 같이 (키 르) 반자동 입력 (qKAT) 인구와 질병 협회 연구에 그들의 응용 프로그램에 대 한 숫자 형식 키 르 유전자를 복사 하는 간단한, 높은 처리량 및 비용 효율적인 방법입니다.
킬러 세포 면역 글로불린 같이 수용 체 (KIRs) 금지 및 활성화 면역 수용 체의, 자연적인 살인자 (NK) 및 T 세포, 유전자의 다형성 클러스터 염색체 19에 의해 설정 됩니다. 그들의 가장 특징이 ligands는 염색체 6에 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 로커 스 이내 인코딩됩니다 인간 백혈구 항 원 (HLA) 분자. 그들은 면역, 재생산, 및 이식, 유전자 형을 정확 하 게 할 수 있는 기술을가지고 중요 한 만드는 중요 한 역할을 재생 하는 실질적 증거는 그들. 그러나, 높은 순서 상 동, 뿐만 아니라 유전자 및 복사 번호 유사, 어렵게 정확 하 게 할 수 있는 디자인 방법 및 효율적으로 유전자 형을 모든 키 르 유전자. 전통적인 방법 일반적으로 가져온 데이터의 해상도, 처리량, 비용 효과성, 및 시간 설정 및 실험을 실행에 제한 됩니다. 우리 설명 양적 키 르 반 자동 입력 (qKAT) 라는 메서드는 키 르 로커 스에 있는 모든 유전자의 유전자 복사 번호를 확인할 수 있는 높은 처리량 다중 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 방법입니다. qKAT은 고해상도 키 르 숫자 데이터 복사, 그들을 포함 하는 구조적 다형성 haplotypes의 변화를 추정 하는 것 더 사용 될 수 있는 제공할 수 있는 간단한 높은 처리량 방법. 이 복사 번호와 haplotype 데이터에 대규모 질병 협회, 집단 유전학, 표현과 키 르 와 HLA간의 기능 상호 작용에 대 한 조사 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.
인간에서는, 살인자 같은 면역 글로불린 수용 체(키 르) 로커 스는 백혈구 수용 체 복합물 (LRC) 내의 염색체 19의 긴 팔에 매핑됩니다. 이 로커 스 길이 약 150 kb 고 15 키 르 유전자 배열 머리-투-꼬리를 포함 한다. 현재 알려진 키 르 loci는 KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR2DL4 KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3 그리고 두 pseudogenes, KIR2DP1 및 KIR3DP1. 키 르 유전자 2 차원 (2D)에 대 한 인코딩 및 짧은 (S; 활성화) 3 차원 (3D) 면역 글로불린과 같은 도메인 수용 체 또는 긴 (L; 억제) 세포질 꼬리, 자연 킬러 (NK) 세포와 T의 하위 집합으로 표현 되는 셀입니다. 복사 번호 유사 키 르 로커 스 양식 내의 변수 진 콘텐츠1다양 한 haplotypes 전시. 비-유전자 동종 재결합 (NAHR), 가까운 머리-투-꼬리 유전자 배열 및 높은 순서 상 동에 의해 촉진 된 haplotypic 변화에 대 한 책임을 질 것을 제안 하는 메커니즘입니다. 100 개 이상의 다른 haplotypes 인구 전세계1,2,,34에 보고 되었습니다. 이러한 모든 haplotypes 두 가지 주요 그룹으로 분할 될 수 있습니다: A와 B haplotypes. A haplotype 포함 7 키 르 유전자: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1및 KIR3DL2, 억제 키 르 유전자, 그리고 활성화 키 르 유전자 KIR2DS4. 그러나, 최대 70% 유럽 근원 개인의 키 르 haplotype를 위해 homozygous 독점적으로 수행 KIR2DS45,6의 비 기능 “삭제” 형태. 다른 모든 키 르 유전자 조합을 형성 그룹 B haplotypes, 특정 키 르 유전자 KIR2DS1, 중 적어도 하나를 포함 하 여 KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, 그리고 KIR2DL5, 일반적으로 두 개 이상의 활성화 키 르 유전자를 포함 하 고.
HLA 종류 I 분자 특정 금지 수용 체 (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3및 KIR3DL1) 활성화 수용 체 (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, 에 대 한 ligands로 확인 되었습니다 KIR2DS5, 및 KIR3DS1), 그리고 KIR2DL4에 대 한 고유 키 르 다른 억제 키 르 수용 체 처럼 긴 세포질 꼬리를 포함 하지만 또한 긍정적으로 위탁된 한 잔류물은 일반적인 세포 외 도메인 근처에 있다 다른 활성화 키 르 수용 체의 기능입니다. 키 르 유전자와 HLA 유전자 이체의 조합 그 모양 잠재적인 NK 세포 응답 개별 레벨7,8수용 체 ligand 상호 작용을 좌우 한다. 유전 협회 학문에서 증거는 키 르 에 역할 (예:., 인간 면역 결핍 바이러스 [HIV]9 , C 형 간염 바이러스 [HCV]10), 바이러스 성 저항 표시는 이식 의 성공 11, 임신 장애, 생식 성공12,13, 수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (HSCT)14,15, 후 재발에 대 한 보호의 위험 16, 그리고 암17의 위험.
높은 순서 상 동의 조합 유전자 그리고 정확 하 게 유전형 키 르 유전자의 작업에서 haplotypic 다양성 선물 도전. 키 르 유전자 입력을 기존의 방법 순서 특정 뇌관 (SSP) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)18,,1920, 시퀀스 특정 oligonucleotide 조사 (SSOP) PCR21, 그리고 매트릭스 보조 레이저 이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF)22desorption. 이러한 기술의 단점은 그들은 단지 부분에 통찰력을 제공 개인의 유전자 형 또한 수행 하는 힘이 드는 되 고 하는 동안 있습니다. 최근 차세대 시퀀싱 (NGS) 키 르 로커 스를 구체적으로 입력에 적용 되었습니다. 이 메서드는 매우 강력 하 고, 하는 동안 실행, 비쌀 수 있다 그리고 그것은 심층 분석 및 데이터 검사를 수행 하면 시간이 많이 소요.
qKAT는 높은 처리량 정량 PCR 방법입니다. 기존의 방법 힘들고 시간이 걸리는 반면, 두 일에 거의 1000 게놈 DNA (gDNA) 샘플을 실행할 수 있게 메서드와 키 르 유전자 유전자 복사 번호 제공. 10 다중 반응, 두 키 르 loci를 대상으로 각각의 이루어져 있다 qKAT 그리고 고정된 복사본 번호 게놈 (STAT6) 키 르 유전자의 상대적 정량화에 대 한 사용에 한 참조 유전자 복사 번호23. 이 분석 결과 유전자 제공 뿐만 아니라 큰 인구 패널 및 HCV, 타입-1 당뇨병 같은 면역 조건 등 전염 성 질환 및 자간 전 증, 같은 임신 장애 질병 동료 연구 성공적으로 사용 되었습니다. NK 세포 기능1,4,,2425,26를 이해 하기 위한 연구에 underpinning.
우리는 소설 반자동된 높은 처리량 메서드를 복사 키 르 유전자. 의 숫자 입력을 용이 하 게 qKAT 설명 방법은 낮은 처리량이 높은 다형성 유전자의 유무만 나타낼 수는 SSP-PCR, 같은 기존의 방법에 비해 개선 이다.
가져온 숫자 데이터 복사의 정확도 품질 및 농도-gDNA 샘플 및는 시 약의 품질의 균일성을 포함 한 여러 요인에 따라 달라 집니다. 이후 유사 농도 격판덮개의 맞은편에 복사 숫자의 계산에서 오류가 발생할 수 있습니다 품질 및 접시에 걸쳐 gDNA 샘플의 정확도 매우 중요 하다. 분석 실험 유럽 원본 샘플 세트를 사용 하 여 확인 했다, 이후 동료는 세계의 다른 부분에서에서 데이터 보다 철저 한 검사를 필요로 합니다. 이것은 대립 유전자 강하 또는 일반적인 뇌관/프로브 바인딩 인스턴스 복사 번호 유사로 오해 하지는 보장 하기 위해.
분석 실험 설계 하 고 높은 처리량으로 실행 하도록 최적화, 하는 동안 그들은 적은 샘플을 실행 하려면 수정할 수 있습니다. 적은 샘플을 분석할 때 자신감 통계 복사 번호 분석 소프트웨어에 영향을 하지만이 알려진된 키 르 유전자 복사 번호와 제어 genomic DNA 샘플에 포함 되어 있고 추가 샘플 복제는 향상 시킬 수 있습니다. 포함 되어 있습니다.
액체/플레이트-처리 로봇 없이 실험실, 멀티 채널 펫을 사용 하 여 마스터 믹스를 적절 수 있습니다 및 판 정량에 수동으로 로드할 수 있습니다.
QKAT의 발달의 뒤에 주요 목표를 만드는 간단 하 고, 높은 처리량, 고해상도, 고 비용 효율적인 방법을 유전자 KIRs 질병에 대 한 협회 연구 했다. 이것은 성공적으로 달성 이후 qKAT 감염 증, 자기 면역 조건, 그리고 임신 장애4, 의 범위를 포함 하 여 몇몇 큰 질병 협회 연구에 키 르 의 역할 조사에서 고용 되어 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
의료 연구 위원회 (MRC), 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (부여 계약 번호 695551)에서 유럽 연구 회의 (ERC)와 국립 보건원 (NIH) 케임브리지에서 자금 지원을 받은 프로젝트 생물 의학 연구 센터와 NIH 연구 혈액 및 이식 연구 단위 (NIHR BTRU) 장기 기증 및 이식 캠브리지 대학에서 보 건국 혈액과 이식 (NHSBT)와 협력 표현 되며 그 저자 반드시 보 건국에서 NIHR, 보건, 또는 NHSBT의.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |