Article de méthode

Paramyxovirus pour tumeur ciblées Immunomodulation : conception et évaluation Ex Vivo

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DOI :

10.3791/58651

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7 janvier 2019

 , 
1Department of Translational Oncology, German Cancer Research Center (DKFZ) and National Center for Tumor Diseases (NCT), 2Faculty of Biosciences, Heidelberg University, 3Department of Medical Oncology, NCT and Heidelberg University Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail détaillé pour la génération et ex vivo de caractérisation des virus oncolytiques pour l’expression des immunomodulateurs, en utilisant le codage bispécifiques lymphocytes T recruteurs comme un exemple de virus de la rougeole. Application et l’adaptation à d’autres plates-formes de vecteur et les transgènes vont accélérer le développement de nouveaux immunovirotherapeutics pour la traduction clinique.

Résumé

Immunothérapie des cancers réussie a le potentiel pour obtenir un contrôle tumoral à long terme. Malgré des succès cliniques récentes, il reste un besoin urgent de traitements sûrs et efficaces adaptés aux profils immunitaire de chaque tumeur. Virus oncolytiques permettent l’induction de la réponse immunitaire anti-tumorale ainsi que l’expression des gènes de tumeur restreints. Ce protocole décrit l’analyse de génération et ex vivo des immunomodulateurs oncolytiques vecteurs. En se concentrant sur les virus de la rougeole vaccin encodage bispécifiques lymphocytes T recruteurs à titre d’exemple, la méthodologie générale peut être adaptée à d’autres espèces de virus et de transgènes. Le flux de travail présenté comprend la conception, clonage, sauvetage et la propagation des virus recombinants. Dosages pour analyser la cinétique de la réplication et l’activité lytique du vecteur, ainsi que des fonctionnalités de l’isolé immunomodulateur ex vivo sont inclus, ce qui facilite la génération de nouveaux agents de développement dans les modèles précliniques et finalement traduction clinique.

Introduction

Virus oncolytiques (OVs) sont développés comme des thérapies de lutte contre le cancer qui spécifiquement répliquer au sein et tuer les cellules de la tumeur tout en conservant les tissus sains intacts. Il est devenu commun de comprendre cette virothérapie oncolytiques (OVT), dans la plupart des cas, ne repose pas uniquement sur la lyse tumorale complète en réplication efficace et la diffusion du virus, mais exige des mécanismes supplémentaires d’action pour la réussite du traitement, y compris vasculaire et stromales ciblage et, surtout, la stimulation immunitaire1,2,3,4. Tandis que plusieurs des premières études OV utilisé virus non modifiées, les recherches actuelles a profité d’une biologique améliorée compréhension, virus biobanques qui contiennent potentiellement roman OVs et les possibilités offertes par génie génétique afin de créer des avancées OV plates-formes5,6,7.

Vu le succès récent de l’immunothérapie, immunomodulateurs transgènes sont particulièrement intéressantes concernant le génie génétique OVs. Expression ciblée de ces produits de gène par les cellules tumorales infectées par OV réduit la toxicité par rapport à l’administration systémique. Ciblage est obtenue en utilisant des virus avec oncoselectivity inhérent ou en modifiant le tropisme viral8. Immunomodulation locale améliore les mécanismes anti-tumorale multi-facettes de OVT. En outre, cette stratégie est instrumentale dans l’interrogation de l’interaction entre les virus, les cellules tumorales et le système immunitaire. À cette fin, ce protocole prévoit un flux de travail applicable et réglable afin de concevoir, clone, sauvetage, propager et valider des vecteurs de paramyxovirus (plus précisément les virus de la rougeole) oncolytiques codant ces transgènes.

Modulation de la réponse immunitaire peut être réalisée par une grande variété de produits de transgene ciblant les différentes étapes du cancer-immunité cycle9, y compris renforcer la reconnaissance de l’antigène tumoral [par exemple, les antigènes associés aux tumeurs (AVA) ou des inducteurs de complex majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I molécules] plus soutenir la maturation des cellules dendritiques pour la présentation des antigènes efficace (cytokines) ; recrutement et activation des cellules immunitaires désirés comme cytotoxiques et des cellules de helper T [chimiokines, bispécifiques recruteurs de lymphocytes T (TSEI)] ; cibler les cellules suppressives comme les lymphocytes T régulateurs, cellules myéloïdes dérivés suppressives, macrophages associées à la tumeur et cancer associés aux fibroblastes (TSEI, des anticorps, cytokines) ; et prévenir l’inhibition des cellules effectrices et épuisement (inhibiteurs de point de contrôle). Ainsi, il existe une pléthore d’agents biologiques. Évaluation de ces immunomodulateurs virus-encodé en ce qui concerne l’efficacité thérapeutique et les synergies possibles ainsi que la compréhension des mécanismes respectifs est nécessaire d’améliorer le traitement du cancer.

Virus à ARN simple brin sens négatif de la famille des Paramyxoviridae sont caractérisées par plusieurs caractéristiques propices à leur utilisation en tant que vecteurs oncolytiques. Il s’agit d’une oncotropism naturelle, grande capacité de génomique pour transgènes (plus de 5 Ko)10,11, efficace de diffusion dont la formation de syncytiums et forte immunogénicité12. Par conséquent, les plates-formes OV canine distemper virus13oreillons virus14, Newcastle disease virus15, virus Sendai16,17, Simien 518et de paramyxovirus Tupaia19 ont été développés. Plus en évidence, vivre de vaccin contre le virus rougeoleux atténué souches (MV) ont progressé dans le développement préclinique et clinique20,21. Ces souches de virus ont été utilisés pendant des décennies pour la vaccination systématique avec une excellente sécurité record22. En outre, il n’y a aucun risque pour la mutagénèse insertionnelle en raison de la réplication strictement cytosolique du paramyxovirus. Un système polyvalent de génétique inverse issu des ADNc anti-génomique qui permet l’insertion de transgènes dans unités de transcription supplémentaires (ATUs) est disponible de11,23,24. Vecteurs de MV symporteur de l’iodure de sodium (MV-NIS) d’encodage pour l’imagerie et de radiothérapie ou de l’antigène carcinoembryonnaire soluble (MV-ACE) comme marqueur de substitution pour l’expression des gènes viraux sont actuellement évalués dans des essais cliniques (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 et NCT00408590). Administration sécuritaire a été confirmée et efficacité antitumorale ont été signalés dans les précédentes études25,26,27,28,29, 30 (évaluée par Msaouel et Al.31), ouvrant la voie à des virus de la rougeole oncolytiques supplémentaires qui ont été développées et testées à l’intérêt. MV encodage immunomodulatrices molécules ciblant les diverses étapes du cycle du cancer-immunité auraient dû être divulgués de ralentir la croissance tumorale et/ou prolonger la survie chez les souris, avec la preuve de leur efficacité immunitaire et à long terme mémoire immunitaire protectrice en syngénique modèles de souris. Les transgènes vecteur codé comprennent stimulant factor (GM-CSF)32,33, H. pylori Activation des neutrophiles protéine34, point de contrôle immunitaire inhibiteurs35, des colonies de granulocytes et macrophages interleukine-12 (IL-12)36, Ava37et TSEI38, qui réticuler un antigène de surface de tumeur avec CD3 et ainsi induire une activité antitumorale par les cellules T polyclonales, quel que soit T cell receptor spécificité et co-stimulation ( La figure 1). Les résultats précliniques prometteurs obtient pour ces constructions de nouveaux efforts translationnelle demande.

Talimogene laherparepvec (T-VEC), un type j’ai le virus herpès simplex encodage GM-CSF, est le seul oncolytiques thérapeutiques approuvés par l’United States Food Drug Administration (FDA) et de l’Agence européenne des médicaments (EMA). L’étude de phase III menant aux homologations en fin 2015 n'a pas seulement montré une efficacité au site d’injection intra-tumorale, mais aussi des effets abscopal (c.-à-d., les remises des lésions non injectés) dans le mélanome avancé,39. T-VEC est entré depuis lors des essais supplémentaires pour application dans d’autres entités de la tumeur (par exemple cancer de la peau non-mélanome, , NCT03458117, cancer du pancréas, NCT03086642) ainsi que l’évaluation des thérapies de combinaison, surtout avec le point de contrôle immunitaire inhibiteurs (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 et Ribas et Al.40).

Cela montre non seulement le potentiel de l’immunothérapie oncolytiques, mais aussi la nécessité de poursuivre les recherches afin d’identifier les combinaisons supérieures de OVT et l’immunomodulation. Une conception rationnelle des vecteurs supplémentaires et leur développement pour les essais précliniques est essentielle pour cette entreprise. Cela fera avancer aussi la compréhension des mécanismes sous-jacents et a des implications pour la progression vers le traitement du cancer plus personnalisée. À cette fin, cette publication présente une méthodologie pour la modification et le développement du paramyxovirus pour immunothérapie ciblée contre le cancer et, plus particulièrement du virus de la rougeole oncolytiques encodage anticorps prise avec des lymphocytes T (Figure 2).

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Protocole

Remarque : [O], [P] et [M] indiquent les paragraphes applicables à : OVs en général, (la plupart) paramyxovirus ou MV, respectivement. [B] indique les sections spécifiques pour BTE transgènes.

1 clonage de transgènes codant immunomodulateur en vecteurs de Virus de la rougeole

  1. [O] conception insérez la séquence.
    1. [O] choisir un immunomodulateur d’intérêt basé sur la recherche dans la littérature ou sur exploratoire des données tels que les écrans génétiques41 et dérivent la séquence d’ADNc pertinents des bases de données appropriées telles que GenBank, l’European Archive de nucléotide, ou la système d’information international immunogénétique (IMGT).
    2. [O] ajouter des fonctionnalités supplémentaires à la séquence du transgène (Figure 3). Une séquence de Kozak précédent et d’optimisation de codons spécifiques à l’espèce peuvent amplifier l’expression. Sequences de signaux sont nécessaires à la sécrétion. Inclure les séquences codant les tags de protéine N - et C-terminal pour la détection et la purification42. Inclure les sites de restriction pour l’insertion dans le vecteur.
      Remarque : [M] des unités de transcription supplémentaires (ATUs) contenant MV polymérase gène se mettent et signaux d’arrêt sont nécessaires pour l’expression de transgènes de génomes MV recombinants. Vecteurs de cDNA anti-génomique adapté, contrôlées par les promoteurs du CMV et ATUs contenant avec des sites de restriction uniques pour l’introduction de transgènes de sens positif aux positions définies, ont été développées précédemment11. [P] adéquate de positionnement du transgène est crucial, car il affecte l’expression réplication et transgène virale en raison du gradient de l’expression typique des paramyxovirus43. Introduction dans une ATU près de l’extrémité 3' du anti-génome (i.e., dans le poste de chef ou en aval du gène P ) donne généralement lieu à l’expression TRANSGENIQUE élevé au détriment de la réplication virale réduite. Une augmentation de la réplication et des niveaux d’expression du transgène peuvent s’attendre lorsque vous utilisez l’ATU en aval du gène H . Emballage du génome de plusieurs paramyxovirus, y compris le virus de la rougeole, requiert la liaison de six nucléotides par chaque de protéines nucléocapside44. Pour insertion de transgènes dans tels virus, faire en sorte que le nombre de nucléotides du génome complet sera divisible par six. Ceci est également dénommé « règle de six »45,46. Si nécessaire, inclure des nucléotides supplémentaires dans la notice (en amont de la séquence de Kozak ou en aval du codon stop) sans introduire des changements de cadre ou de codons stop prématurés. [M] éviter des séquences particulières dans le transgène qui ressemblent aux début de gène MV (AGGRNCMARGW) et d’arrêt des signaux (RTTAWANAAAA) et l’ARN montage de séquences (AAAAAGGG). Ces séquences consensus ont été publiés (voir, par exemple, parcs et al.,47).
    3. [O] acheter des oligonucléotides de la séquence souhaitée ou assembler des séquences disponibles à l’aide de clonage moléculaire standard48.
      Remarque : [O] pour l’amplification PCR du transgène, concevoir une amorce vers l’avant, y compris le site de restriction en amont et les premiers nucléotides de 15-20 de l’insert et une amorce inverse, y compris les derniers 15-20 nucléotides de l’insert suivies de la restriction en aval site.
  2. [O] insert clone dans l’ADN codant le génome viral (anti-).
    1. [O] cloner l’insert dans les vecteurs d’ADN ou de anti-génomes ADN de virus à ARN en norme moléculaire clonage techniques48 (p. ex., enzymatique restriction suivie par ligature d’ADN).
      1. [O] empêcher la re-ligature du vecteur en utilisant des sites de restriction non compatible ou en dé-phosphorylation avant la ligature.
      2. [O] isoler le produit de la ligature par électrophorèse sur gel d’agarose et purification subséquente de gel à l’aide de kits disponibles dans le commerce. En général, l’efficacité optimale de la ligature est atteint à un ratio de 3:1 molaire de l’insert à vector.
    2. [O] transformer le produit de la ligature en bactéries compétentes adapté pour une récupération efficace des plasmides (p. ex., effectuer un choc thermique d’e. coli49) et d’identifier des clones bactériens contenant l’ADN correct par colonie PCR50 .
    3. [O] isoler l’ADN amplifié d’un seul clone bactérien à l’aide de trousses de préparation ADN disponibles dans le commerce. Vérifier l’intégrité génomique par digest de contrôle avec des enzymes de restriction appropriées (par exemple, HindIII pour génomes MV [M]). Confirmer une insertion correcte et intégrité du transgène par séquençage.
      Remarque : [M] pour effectuent des transgènes insérés dans le MV H- ATU, Sanger sequencing avec les amorces suivants : H-9018 [amorce vers l’avant, se lie à la position de génome de MV 9018 dans le H open reading frame (ORF)] : 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3' ; L-9249 + (reverse primer, se lie à la position de génome MV 9249 dans l’ORF L ) : 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. sauver les particules de Virus de la rougeole Recombinant encodage immunomodulateurs

  1. [O] générer des particules virales recombinantes de (anti-) génomique ADN via la transfection de cellules producteur virus selon le protocole standard pour le virus respectif. Suivez les directives pour le travail dans des conditions stériles. Culture cellulaire sous capot, effectuer en particulier toutes les mesures impliquant des virus dans des enceintes de sécurité biologique de classe II.
    1. [M] pour le sauvetage de virus de la rougeole du cDNA23,24, plaque producteur MV (singe vert africain rein-dérivé Vero) uniformément sur une plaque de 6 puits 24h avant la transfection des cellules. Graine 2 x 105 cellules dans 2 mL moyen de (DMEM de l’aigle de la modification de Dulbecco) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) / puits pour atteindre confluence de 65 à 75 % lors de la transfection.
      Remarque : [P] réduire le nombre de cellules si les cellules proliférer avant la formation de syncytiums Viro-induite.
    2. [P] transfecter les cellules avec l’ADN codant les plasmides virale helper anti-génome, nécessaire, et, si vous le souhaitez, un plasmide codant un journaliste fluorescent pour évaluer l’efficacité de transfection.
      1. [M] Mix 5 µg d’ADN recombinant codant la rougeole virus anti-génome, 500 ng de chacun des plasmides d’expression mammifère encodage des virus de la rougeole N et L protéines et 100 ng de chacun des plasmides codant la protéine P et un journaliste fluorescent dans un volume total de 200 µL DMEM.
      2. Ajouter 18,6 µL de réactif de transfection liposomale, mélanger immédiatement en effleurant le tube et incuber pendant 25 min à température ambiante (RT).
      3. [P] remplacer le support par 1,8 mL de DMEM, 2 % FBS, 50 µg/mL kanamycine (ou autres antibiotiques pour prévenir la contamination) par puits, puis ajouter le mélange de transfection goutte à goutte dans le puits et agiter soigneusement. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C, 5 % de CO2. Remplacer le support avec 2 mL de DMEM fraîche, 2 % FBS et kanamycine 50 µg/mL le lendemain ; Répétez cette procédure lorsque le milieu devient acide.
        Mise en garde : [O] gérer les cellules et les matériaux selon la réglementation sur la biosécurité, car le virus peut être présent de transfection par les étapes suivantes. Éliminer correctement les déchets (infectieux).
  2. [P] recueillir et propager des particules virales.
    1. [P] observer cellules quotidiennement par microscopie pour la formation d’expression et syncytiums gène rapporteur (Figure 4). Récolter les virus quand grands syncytiums, constituées de cellules de 20 ou plus, sont visibles, ou quand les cellules deviennent trop denses (i.e., quand ils commencent à se développer en plusieurs couches, généralement après 7 à 9 jours).
      Remarque : [P] si aucun syncytiums ne sont observés dans une construction de vecteur donné, cela ne signifie pas nécessairement que le sauvetage n’a pas réussi. Comme le virus infectieux peut néanmoins être présent dans l’échantillon, transférer aux cellules fraîches producteur pour passage.
    2. [P] la graine environ 1,5 x 106 cellules de producteur dans 12 mL de DMEM avec 10 % FBS, sur 10 cm plats 24h avant la récolte anticipée, ou 2,5 x 106 cellules / plaque 4 – 6 h avant le passage du virus à atteindre confluence de 65 à 75 % au moment de l’inoculat virus ion.
    3. [P] pour collecter les descendants du virus, délicatement racler les cellules de la plaque à l’aide d’un grattoir de cellules adhérentes producteur et transférer le surnageant contenant les cellules dans un tube à centrifuger. Enlever les débris de cellules par centrifugation pendant 5 min à 2 500 g et 4 ° C.
      Remarque : Raclée de cellules peuvent être transférés directement sans centrifugation afin d’optimiser le report de virus au détriment des conditions de culture sous-optimales et éventuels artefacts de microscopie.
      Attention: Evitez de [O] renverser les médias lorsque le raclage des cellules. Réduire au minimum la formation d’aérosols.
    4. [P] préparer l’inoculum en mélangeant le surnageant acellulaire de l’étape 2.2.3 avec un milieu sans sérum pour un volume final de 4 mL. Remplacer le support sur les cellules de producteur de l’inoculum et incuber les cellules pendant au moins 2 h à 37 ° C et 5 % de CO2. Ajouter 6 mL de DMEM avec 10 % FBS et incuber les cellules pendant la nuit avant de changer le support à 12 mL de frais DMEM avec 10 % FBS.
    5. [P] Observe les cellules au moins deux fois par jour et le virus de la récolte avant l’éclatement de syncytiums (p. ex., , lorsque la rupture de la membrane devient visible). Pour récolter le premier passage du virus, retirer le surnageant de la plaque, ajouter 600 µL de milieu sans sérum, gratter les cellules avec un releveur de cellule et transférer dans un tube propre.
      Remarque : [M] selon le virus souche51,52 et la progression de l’infection, plaques avec les cellules infectées de transfert à 32 ° C pour faciliter la propagation et la réplication virale. En général, les souches Schwarz MV propagent bien à 37 ° C, alors que le transfert de cellules infectées par le virus de souche Edmonston B aux résultats de 32 ° C dans la formation de syncytiums plus lente mais des titres plus élevés.
      Remarque : [P] ne laissez pas la couche de cellules de sécher pendant la récolte, car cela se traduira par une diminution de l’infectiosité des particules virales. Bien que certains virus est perdue lorsque vous jetez le liquide surnageant des cellules infectées, des titres plus élevés peuvent provenir de la couche de cellules.
    6. [P] immédiatement geler la suspension virale dans l’azote liquide. Conserver à-80 ° C pendant au moins 24 h assurer la profondeur de gel. S’étendre à plusieurs jours d’interrompre la procédure, si nécessaire.
    7. Libération des particules virales de décongélation à 37 ° C. Homogénéiser au vortex et centrifuger pendant 5 min à 2 500 g et 4 ° C. Transférer les surnageants cryotubes étiquetés et conserver à-80 ° C.
      Remarque : [O] stocker virus aliquote tailles adéquates à des expériences ultérieures, car elles sont préférentiellement décongelées qu’une seule fois et utilisés immédiatement. [P] en outre gel-dégel cycles ou stockage à 4 ° C pendant plusieurs jours entraîne une réduction significative des titres viraux.
    8. [P] un jour avant le passage plus loin pour atteindre le montant requis et titre, 4 x 106 cellules de producteur dans 12 mL de DMEM avec 10 % de graines FBS sur des plats de 15 cm. Inoculer le virus à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,03. Infecter dans 8 mL de milieu sans sérum par plaque et modifier milieu DMEM avec 10 % FBS après incubation des cellules au moins 2 h. échelle vers le haut à l’aide de plusieurs plaques.
    9. Récolte tel que décrit dans étape 2.2.5, quand syncytiums sont répandues à travers la couche de cellules entières. Mettre en commun les suspensions obtenues en tubes de 50 mL et processus tel que décrit dans les étapes 2.2.6–2.2.7.
      Remarque : [O] il est essentiel de vérifier toutes les plaques visuellement pour contamination bactérienne et fongique avant la récolte. En général, de vérifier toutes les lignées cellulaires régulièrement pour contamination par mycoplasmes ou virus fortuits de PCR multiplex.
  3. [P] Evaluate titres viraux. Déterminer les titres des stocks de virus d’octuplicates par aliquote à l’aide de plaques de 96 puits. Effectuer le titrage des trois aliquotes individuels par sauvetage de virus et la valeur moyenne permet de calculer la quantité de suspension virale à être utilisés dans des expériences.
    1. [P] piscine le producteur de cellules, comte et ajuster à 1. 5 x 105 cellules / mL en DMEM avec 10 % FBS.
    2. [P] ajouter 90 µL de DMEM avec 10 % FBS dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.
    3. [P] ajouter 10 µL d’une aliquote de l’encours de virus dans tous les puits de 8 dans la première colonne de la plaque et bien mélanger en pipettant également, haut en bas, au moins 10 fois.
    4. [P] effectuer des dilutions 10 fois du virus. Transférer 10 µL de chaque puits de la première à la deuxième colonne à l’aide d’une pipette multicanaux. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas et utilisez des embouts frais pour chaque étape de dilution. Jetez 10 µL de chaque puits de la dernière colonne.
      Remarque : Chaque plaque à 96 puits permet 12 étapes de dilution en série. [M] pour des vecteurs de MV, 8 étapes de 10 fois les dilutions sont généralement suffisantes, comme les titres ci-dessus unités infectieuses de 1 x 109 cellules/ml (ciu) sont rarement obtenues par la méthode de propagation décrite à l’étape 2.2. [P] contrôle puits sans virus peuvent être utilisés aux fins de comparaison et de surveiller la contamination.
    5. [P] ajouter 100 µL de suspension cellulaire dans chaque puits et incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 48 h. s’assurer que l’absence d’amas de cellules dans la suspension d’atteindre une répartition homogène des cellules.
    6. [P] rechercher les syncytiums à l’aide d’un microscope optique. Compter les syncytiums dans chaque puits de la colonne avec le plus grand facteur de dilution contenant syncytiums visibles.
    7. [P] calcule le nombre moyen de syncytiums / puits dans cette colonne en divisant le nombre total de syncytiums par huit. Multiplier cette moyenne avec le facteur de dilution de la colonne respective, à partir de 102 SDI / mL pour la première colonne53 (voir la Figure 5 par exemple).

3. déterminer la capacité réplicative et cytotoxiques de vecteurs viraux codant immunomodulateurs

  1. [O] comparer les cinétiques de la réplication du virus recombinant généré et le vecteur non modifié avec des courbes de croissance en une seule étape ou à plusieurs étapes (GCs). One-step GCs, progénitures virales sont évalués suivant l’infection simultanée de toutes les cellules (théoriquement, 100 % d’infection). Début de GCs multi-étapes à un faible pourcentage de cellules infectées de suivre plusieurs cycles de réplication du virus.
    1. [M] pour l’analyse de la cinétique de la rougeole virus replication, 1 x 105 cellules de Vero dans 1 mL de DMEM avec 10 % de graines FBS / puits sur plaques de 12 puits un jour avant l’infection. Plaque d’au moins deux puits pour chaque validant d’intérêt comme les répétitions techniques.
    2. [O] infectent les cellules par le virus à faible MOI pour plusieurs étapes ou à un MOI élevé pour une étape GCs [M] (0,03 et 3 pour la réplication de MV sur Vero cellules, respectivement). Remplacer le moyen avec 300 µL de milieu sans sérum contenant la quantité respective de virus et incuber à 37 ° C et 5 % CO2 pendant au moins 2 h. retirer inoculum, ajouter 1 mL de DMEM avec 10 % FBS et continuer d’incubation.
    3. [P] à intervalles pertinents tels que 12, 24, 36, 48, 72 et 96 heures après l’infection, récoltent des progénitures virales en grattant directement les cellules dans le milieu. Transférer le contenu de chaque puits à un tube individuel, clin d’oeil-congélation dans l’azote liquide et stocker à-80 ° C jusqu’au titrage.
      Remarque : [P] échantillons peuvent être mises en commun à cette étape pour l’analyse des titres moyens.
    4. [P] collecte d’échantillons de tous les points. Décongelez simultanément à 37 ° C pendant l’évaluation de la progéniture virale. Vortex et pellet débris cellulaires par centrifugation pendant 5 min à 2 500 x g et 4 ° C.
    5. [P] calculer la moyennes titres de chaque construction et validant comme décrit ci-dessus. Tracer des titres au fil du temps. Comparer les courbes de croissance des vecteurs avec et sans les transgènes insérés, avec différents transgènes ou transgènes insérées à différentes positions (voir la Figure 6A).
  2. [O] comparez avec activités lytiques des virus immunomodulateur-codage et non modifiées.
    1. [O] sélection à partir des méthodes possibles, y compris les mesures d’impédance, lactate déshydrogénase (LDH) libérer dosage ou des analyses de viabilité cellulaire colorimétrique axée sur le métabolisme [p. ex., 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT ) et 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) tests].
      1. [M] pour analyser la cytotoxicité de la rougeole, vecteurs de virus en utilisant XTT assay, cellules Vero de graines comme indiqué au point 3.1.1. Inclure les répétitions d’un contrôle non infectés pour chaque validant.
        Remarque : [O] réalisation XTT essai à des intervalles différents sur le même échantillon peut limiter les erreurs techniques, mais des lavages répétés et l’exposition au réactif XTT affecte un nombre de cellules viables. Impédance fournit une lecture alternative pour les mesures en continu.
    2. [M] infectent les cellules Vero à un MOI de 1 comme indiqué au point 3.1.2.
      Remarque : [M] pour l’infection des cellules de cible moins permissives telles que certaines lignées de cellules tumorales murines, un MOI supérieur de 3 ou 5 peut être nécessaire.
    3. [O] à points d’intérêt (p. ex.., 12, 24, 36, 48, 72 et 96 heures après l’infection) préparer la quantité requise de réactif XTT (i.e., 300 µL par puits plus 10 % excès). Éviter l’exposition à la lumière.
    4. [M] à chaque validant, retirez le moyen de puits respectifs. Remplacer par 300 µL de réactif XTT et incuber à 37 ° C dans l’obscurité. Recueillir les surnageants lorsque le réactif dans les puits de contrôle a tourné rouge-foncé, qui prend généralement entre 15 min et 2 h, et congeler à-20 ° C.
      Remarque : [O] temps d’incubation dépendent de la construction de virus, type de cellules, la densité et effet cytopathique.
    5. [O] après avoir recueilli tous les échantillons, décongeler en même temps. Transférer 100 µL de chaque échantillon dans une plaque à 96 puits et mesurer l’absorbance optique à 450 nm, avec 630 nm comme une longueur d’onde de référence.
    6. [O] reporter points (axe x) vs. absorbance optique des échantillons par rapport aux témoins, ce qui indique une activité métabolique comme substitut pour la viabilité cellulaire (axe y). Diminution de l’absorbance relative au fil du temps implique une cytotoxicité virale (voir la Figure 6B).

4. analyser l’activité des Virus-encodé immunomodulateurs sécrétée par les cellules infectées

  1. [O] isoler transgène sécrétées produits exprimé par les cellules infectées par le virus cible.
    1. [P] laisser producteur virus cellules se développent à la confluence de 70 % dans des flacons de T175.
    2. [P] supprimer moyen de cellules et laver deux fois avec 12 mL de PBS pour enlever le sérum. Ensemencer les cellules par le virus à un MOI de 0,03 à 12 mL de milieu sans sérum et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant la nuit. Remplacer moyen avec 12 mL de milieu sans sérum frais.
      1. [M] pour virus Edmonston B, cellules de transfert de 37 à 32 ° C après 40 h pour un autre 24 h d’incubation pour faciliter l’infection et prévenir un éclatement prématuré de syncytiums. Selon la souche du virus progression de52 et syncytiums51,, températures d’incubation et temps peuvent être ajustés aux pureté et un rendement optimal de protéines.
    3. [P] soigneusement collecter des surnageants sans décollement des cellules avant l’éclatement de syncytiums. Idéalement, syncytiums ont essaimé à travers la couche de cellules entières. Réunir les fractions surnageantes en tubes de 50 mL.
      Remarque : [P] pour purification efficace du produit transgénique, éviter l’éclatement de syncytiums et minimiser les débris cellulaires lorsqu’ils pêchent les surnageants des cellules infectées.
    4. [P] retirer les débris cellulaires du surnageant par centrifugation pendant 5 min à 2 500 x g et 4 ° C et en passant à travers les filtres 0,22 µm. Selon le volume total du filtrat, ceci peut être effectué à l’aide d’une seringue ou une pompe à vide.
    5. [O] isoler transgène produit en utilisant une méthode de purification appropriées. Purifier les protéines avec une balise hexa-histidine (His) par chromatographie d’affinité échange sur Ni-NTA mini spin colonnes38 tel que décrit ici en bref (pas 4.1.5.1–4.1.5.4).
      Remarque : [O] exécutez toutes les étapes rapides et sur glace. Refroidir les tampons et pré cool centrifuger à 4 ° C.
      1. [O] préparer 100 mL de tampon PBS, chlorure de sodium 200 mM et imidazole à la concentration finale de 10 mM (tampon de lavage 1, WB1), 20 (lavage tampon 2, BB2) et 500 mM (tampon d’élution, EB). Ajuster le pH de WB1 et BB2 à 8.0 et de EB à 7.0. Fonction de la protéine à être purifié, concentrations en imidazol peuvent doivent être ajustés.
      2. [O] equilibrer les colonnes contenant 600 µL de WB1 et centrifuger à 800 x g pendant 2 min avec un couvercle ouvert.
      3. [O] charge 600 µL de surnageants filtrées sur colonnes. Autoriser la liaison des protéines His-étiquetées à la matrice colonne par centrifugation à 200 x g pendant 5 min avec un couvercle fermé. Chargement et la liaison peuvent être répétés jusqu'à un total de 300 µg protéine His-étiquetée par colonne.
      4. [O] laver trois fois avec WB1 et une fois avec BB2, ou jusqu'à ce que le cheminement est incolore. Ajouter 600 µL de tampon et un essorage à 800 x g pendant 2 min avec le couvercle ouvert.
      5. [O] éluer les protéines dans un nouveau tube en effectuant deux étapes d’élution avec 300 µL de EB et centrifugation pendant 2 min à 800 g.
      6. [O] desalt et concentrer le produit à l’aide de filtres centrifuges selon la taille du produit. Ajouter de PBS de 15 mL et filtre par centrifugation pendant 10 min à 4 000 x g. Répéter jusqu'à ce que la pureté désirée et la concentration est réalisée. Pour augmenter la concentration de protéines, réduisez le volume final à environ 200 µL par centrifugation pendant 40 min à 4 000 x g.
  2. [O] confirment l’identité du produit et la pureté.
    1. [O] quantifier la quantité de protéines totales dans les isolats à l’aide des tests colorimétriques standards comme l’acide bicinchoninic (BCA) ou Bradford dosage54,55. [M] des valeurs peuvent varier de 1 à 3 µg transgénique produit par surnageant mL des cellules infectées.
    2. [O] pour quantification relative des isolats de protéine, séparer via l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) et exécution Coomassie coloration56.
    3. [O] confirment l’identité des produits purifiés par immunotransfert utilisant des anticorps spécifiques ciblant la protéine ou un peptide associé tag57.
    4. [O] analyser la spécificité de liaison des protéines à l’aide de techniques appropriées qui peuvent inclure le dosage immuno-enzymatique (ELISA) ou cytométrie en flux (voir Figure 7). Liaison de cellule peut être confirmée à l’aide d’un dosage de pulldown magnétiques récemment décrite38.
      Remarque : [O] utilisation des contrôles appropriés. Dans les essais de liaison cellulaire, incluent des contrôles négatifs avec cellules n’exprimant ne pas la molécule ciblée (comme dans la Figure 9) et les substituts de protéine ne pointeraient (Figure 8). Dans les expériences de cytométrie en flux, sont positifs, négatifs et isotype contrôles (Figure 7).
      1. [O] co incuber la cible des cellules et protéines isolat pour autoriser la liaison. [B] pour lier analyse des TSEI de sang périphérique des cellules mononucléaires (PBMC) isolées du sang humain58, incuber 2. 5 x 106 cellules avec 200 ng de BTE dans 100 µL de PBS 1 % FBS (tampon de liaison, BB) pendant 1 h sur la glace.
      2. [B] cellules de lavage avec 1 mL de BB pour éliminer les protéines non lié. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 100 µL de BB. Ajoutez l’anticorps biotinylé cible la protéine d’intérêt ou d’une balise de peptide associé et incuber sur glace pendant 30 min. Pour les TSEI avec étiquette d’hémagglutinine (HA) de grippe, utilisation 100 ng d’anti-HA-biotine (clone 3F10).
      3. [B] laver deux fois avec 1 mL de BB, les cellules et resuspendre dans 80 µL de BB. Ajouter 20 µL de microbilles magnétiques streptavidine couplé et incuber pendant 15 min à 4 ° C.
      4. [B] lavage une fois pour enlever les cordons excès et resuspendre le culot dans 500 µL de BB additionné de 2 mM EDTA (tampon de la colonne, CB).
      5. [B] isoler les cellules avec des colonnes et un support magnétique selon le manuel du fournisseur.
        1. [B] Equilibrer en permettant à 500 µL de CB pour passer à travers la colonne par écoulement gravitaire.
          Remarque : [B] la colonne ne doit jamais fonctionner à sec. Pipette avec soin et dégazer les mémoires tampons pour éviter les bulles.
        2. [B] placer un tube propre au titre de la colonne et d’appliquer la suspension cellulaire/perle à la colonne. Laver la colonne trois fois avec 500 µL de CB / cycle de lavage. Prélever des échantillons d’intermédiaires de la suspension et d’au moins la première étape de lavage dans le tube, puis stocker sur la glace.
        3. [B] éluer les cellules liées aux perles retenus par le champ magnétique. À cette fin, retirer la colonne du support magnétique, placez-le sur un tube propre, ajouter 1 mL de CB et rapidement pousser le tampon par le biais de la colonne dans le tube à l’aide d’un piston. Maintenir le tube sur la glace.
      6. [B] centrifugeuse tubes contenant les échantillons accréditives et élution pendant 20 min à 16 000 x g et 4 ° C pour granuler des cellules. Jeter le surnageant et lyser les cellules dans un tampon immunoprécipitation (RIPA) (suggéré : 75 µL). Effectuer le SDS-PAGE56.
      7. [B] exécuter immunoblotting utilisant un anticorps primaire approprié. Les anticorps peuvent cibler le produit transgénique ou une protéine cellulaire (par exemple., β-actine, Figure 8) pour évaluer la liaison BTE-cellule.
  3. [O] évaluer la fonctionnalité immunologique des immunomodulateurs isolés.
    1. [O] identifier les essais pertinents selon les caractéristiques de l’immunomodulateur codé. Concernant l’activité immunomodulatrice attendus, méthodes d’évaluation de la prolifération cellulaire, migration, maturation, activation ou cytotoxicité peut être appliquée.
      Remarque : [O] la prolifération cellulaire peut être analysée par CFSE59 étiquetage ou coloration de Ki6760. Expériences Transwell ou scratch sont disponibles pour l’analyse de migration cellulaire61. La maturation et l’activation des cellules peuvent être évaluées à l’aide des protocoles de coloration appropriées pour marqueurs respectifs. [B] parmi les techniques disponibles pour évaluer la cytotoxicité cellulaire médiée par BTE impédance mensurations et chrome communique de dosage. Si opter pour le test de libération Chrome, observer les mesures de sécurité appropriées lors de la manipulation de matières radioactives.
    2. [B] comme une alternative non radioactive, ce qui suit décrit en détail comment évaluer induite par l’ETA, cell-mediated cytotoxicity par test de libération LDH (décrit plus haut dans la brève38).
      1. [B] décider des conditions à être testés au cours de l’expérience (voir la Figure 9 par exemple). On les concentrations (heures et jours), de l’immunomodulateur (pg/mL à µg/mL) et effectrices aux rapports de cellule (E:T) de cible (entre 01:50 et 50 : 1, par exemple) peut être modifiée. Toujours préparer les échantillons en géométrie.
      2. [B] comportent des échantillons sans protéine et sans cellules effectrices, contrôles de LDH spontanée libérer des types de cellule unique (Tsp et Esp), un contrôle maximal de lyse cible cellulaire (Tmax) avec un détergent ajouté avant lecture, un milieu qu’un contrôle et un réglage du volume pour Tmax.
        Remarque : [B] requis nombre de cellules cibles et temps d’incubation peut varier. Effectuer des séries de tests initiaux sans cellules effectrices et immunomodulateurs pour identifier les paramètres optimaux. Inclure Tsp et échantillonsmax T et des contrôles correspondants afin d’évaluer les points et le nombre de cellules différentes.
      3. [B] isoler les cellules effectrices immunitaire par exemple, en (centrifugation en gradient de densité du sang humain pour obtenir les PBMC58 ) ou de la sélection négative des cellules de T murines de souris splénocytes62.
      4. [B] graine de cible les cellules selon étape 4.3.2 (p. ex., 5 x 10³ / puits) dans une plaque de fond U 96 puits.
      5. [B] ajouter la protéine isolée à des concentrations souhaitées pour les échantillons respectifs. Ajouter les cellules effectrices immunitaires à des rapports souhaités. Ajouter moyen pour un volume total de 100 µL / puits.
      6. [B] incuber pour le laps de temps déterminé dans l’étape 4.3.2, généralement entre 4 et 48 h (24h pour PBMC non stimulées et 48 h pour cellules de T murines fraîchement isolées ; plus courtes durées d’incubation peuvent s’appliquer pour les cellules immunitaires antagoniste), à 37 ° C et 5 % de CO2.
      7. [B] 45 minutes avant de prélever les échantillons, ajouter 10 µL de solution de lyse x 10 aux puits contenant des échantillons demax T et le moyen correspondant. Continuer d’incubation.
      8. [B] spin down cellules à 250 x g pendant 4 min. transférer 50 µL de chaque surnageant dans une plaque à 96 puits à fond plat. Ne transférez pas les cellules pour éviter la LDH liée à la cellule.
      9. [B] préparer la solution de substrat selon le fabricant. Ajouter 50 µL à chaque puits et incuber à RT dans l’obscurité pendant 30 min ou jusqu'à ce que les échantillons de Tmax virent au rouge profond.
      10. [B] ajouter 50 µL de solution d’arrêt dans chaque puits. Enlever les bulles d’air par centrifugation pendant 1 min à 4 000 x get manuellement avec une aiguille creuse. Mesurer l’absorbance optique à 490 nm.
      11. [B] calculer les valeurs spécifiques de la lyse % pour chaque échantillon.
        1. [B] calculer les moyennes pour les répétitions des commandes moyennes avec et sans solution de lyse. Soustraire des valeurs obtenues d’échantillons expérimentaux et de Tmax et contrôles de la libération spontanée, respectivement. Utilisez ces valeurs de référence-corrigée pour les autres calculs.
        2. [B] calculer les moyennes corrigées TmaxTspet Esp contrôles. L’utilisation de ces valeurs moyennes, l’équation suivante donne le pourcentage de lyse spécifique pour chaque échantillon :

          figure-protocol-1
        3. [B] tracer % lyse spécifiques valeurs par rapport à la concentration de protéines ou de ratio E:T et comparer à des échantillons de contrôle ne pointeraient.

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Résultats

La figure 1 illustre le mécanisme d’action du virus de la rougeole oncolytiques encodage bispécifiques recruteurs de lymphocytes T. Un organigramme illustrant le flux de travail de ce protocole est présenté à la Figure 2. Figure 3 illustre un exemple d’un génome de virus de la rougeole oncolytiques modifiés. Cela fournit une représentation visuelle des changements spécifiques appliq...

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Discussion

Oncolytique immunothérapie (i.e., OVT en combinaison avec l’immunomodulation) est très prometteur pour le traitement du cancer, exigeant davantage développement et optimisation de virus oncolytiques codant des protéines immunomodulatrices. Ce protocole décrit les méthodes pour générer et valider ces vecteurs pour contrôle ultérieur dans des modèles précliniques appropriés et potentielle future traduction clinique en nouveaux traitements contre le cancer.

Nombreuses plates-formes de vi...

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Déclarations de divulgation

C.E. Engeland est répertorié comme co-inventeur d’un brevet en ce qui concerne les virus à ARN pour Cancer Immunovirotherapy appartenant à l’Université de Heidelberg. J.P.W. Heidbuechel n’a rien à divulguer.

Remerciements

Ces méthodes ont été établies dans le groupe virothérapie dirigé par Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts au Centre National pour les maladies tumorales à Heidelberg. Nous sommes reconnaissants envers lui et tous les membres de l’équipe du laboratoire, en particulier le Dr Tobias Speck, le Dr Rūta Veinalde, Judith Förster, les Birgit Hoyler et que les Jessica Albert. Ce travail a été soutenu par l’autre Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 à C.E. Engeland) et l’allemand National Science Foundation (DFG, accorder EN 1119/2-1 à Engeland C.E.). J.P.W. Heidbuechel reçoit une allocation de la Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Rapid DNA Dephos & Kit de ligatureRoche Life Science, Mannheim, Allemagne4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit ThermoFisher Scientific, St. Leon-RotK1231
AgaroseSigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneA9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden, Allemagne28704
NEB 10-beta Competent E. coliNew England Biolabs (NEB), Francfort-sur-le-Main, AllemagneC3019I
LB moyen d’après LennoxCarl Roth, Karlsruhe, AllemagneX964.1
AmpicillineCarl Roth, Karlsruhe, AllemagneHP62.1
QIAquick Miniprep KitQIAGEN, Hilden, Allemagne27104
Enzyme de restriction HindIII-HFNew England Biolabs (NEB), Francfort-sur-le-Main, AllemagneR3104S
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)Invitrogen, Darmstadt, Allemagne31966-021
Sérum fœtal bovin (FBS)Biosera, Boussens, FranceFB-1280/500
FugeneHDPromega, Mannheim, AllemagneE2311peut être remplacé par le réactif de transfection de choix
KanamycinSigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneK0129
Cellules VeroATCC, Manassas, VA, USACCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46J. Heidbuechel, DKFZ Heidelbergdisponible sur demande
Granta-519DSMZ, Braunschweig, AllemagneACC 342
Opti-MEM (milieu sans sérum)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Allemagne31985070
Cellule colorimétrique Le kit de viabilité III (XTT)PromoKine, Heidelberg, AllemagnePK-CA20-300-1000comprend le réactif XTT
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de DulbeccoGibcoLife Technologies, Darmstadt, Allemagne14190-094
Colonnes de centrifugation QIAquick Ni-NTAQIAGEN, Hilden, Allemagne31014
Chlorure de sodiumCarl Roth, Karlsruhe, Allemagne3957.3
ImidazoleCarl Roth, Karlsruhe, AllemagneI5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10  ; kDaMerck, Darmstadt, AllemagneUFC901024
BCA Protein Assay KitMerck Milipore71285-3
IgG à partir de sérum humainSigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneI4506
Anti-HA-PEMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne130-092-257RRID :
AB_871939 Souris IgG1, contrôle des isotypes kappa, conjugué à la phycoérythrine, clone MOPC-21 anticorpsBD Biosciences, Heidelberg, Allemagne555749RRID : AB_396091
Anticorps anti-HA-biotine, clone 3F10Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne12158167001RRID : AB_390915
Microbilles anti-biotineMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne130-090-485
MS ColumnsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne130-042-201
Séparateur MiniMACSMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne130-042-303
Tampon RIPARockland Immunochemicals, Gilbertsville, Pennsylvanie, États-UnisMB-030-0050
CytoTox 96 Essai de cytotoxicité non radioactivePromega, Mannheim, AllemagneG1780comprend une solution de lyse 10x, une solution de substrat (mélange de substrat et tampon de dosage) et une solution d’arrêt
Élévateur de cellulesCorning, Reynosa, Mexique3008
Boîtes de 10 cmCorning, Oneonta, NY, États-Unis430167 Boîtes de
15 cmGreiner Bio-One, Frickenhausen, Allemagne639160
Plaques à 96 puits, Fond en UTPP, Trasadingen, Suisse92097
Plaques à 96 puits, fond platNeolab, Heidelberg, Allemagne353072
Plaques à 6 puitsNeolab, Heidelberg, Allemagne353046
Plaques à 12 puitsNeolab, Heidelberg, Allemagne353043
Tubes de 50 mLnerbe plus, Winsen/Luhe, Allemagne02-572-3001
Fioles de culture cellulaire T175Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot159910
0.22 & micro ; m filtersMerck, Darmstadt, AllemagneSLGPM33RS

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