Denne protokol beskriver en detaljeret arbejdsgang for generation og ex vivo karakterisering af oncolytic virus for udtryk for hæmmende, ved hjælp af mæslinger virus kodning bispecific T-celle ager som eksempel. Ansøgning og tilpasning til andre vektor platforme og transgener vil fremskynde udviklingen af nye immunovirotherapeutics for klinisk oversættelse.
Vellykket cancer immunterapi har potentiale til at opnå langsigtet tumor kontrol. Trods nylige kliniske succeser stadig der et presserende behov for sikre og effektive behandlinger skræddersyet til individuelle tumor immun profiler. Oncolytic virus aktiverer induktion af anti-tumor immunrespons samt tumor-begrænset genekspression. Denne protokol beskriver generation og ex vivo analysen af immunmodulerende oncolytic vektorer. Med fokus på mæslinger vaccine virus kodning bispecific T-celle ager som eksempel, kan den generelle metode tilpasses til andre virus arter og transgener. Arbejdsprocessen præsenteres omfatter design, kloning, redning og formering af rekombinant vira. Assays til at analysere replikation kinetik og lytisk aktivitet af vektoren samt funktionalitet af den isolerede Immunmodulator ex vivo er inkluderet, således at lette generation af roman agenter for yderligere udvikling i prækliniske modeller og i sidste ende kliniske oversættelse.
Oncolytic virus (OVs) er ved at blive udviklet som anti-cancer terapi, der specifikt replikere inden for og dræbe tumorceller mens forlader raske væv intakt. Det er nu blevet fælles forståelse at oncolytic virotherapy (OVT), i de fleste tilfælde, ikke stole udelukkende på komplet tumor lysering af effektiv replikering og spredning af virus, men kræver yderligere virkningsmekanismer for behandling succes, herunder vaskulære og stromale målretning og vigtigere, immunstimulering1,2,3,4. Mens mange snarlig OV undersøgelser anvendes uændret vira, Aktuel forskning har nydt godt af en bedre biologisk forståelse, virus biobanker, der potentielt indeholder roman OVs, og genteknologi muligheder for at skabe avancerede OV platforme5,6,7.
I betragtning af den seneste succes for immunterapi, er immunmodulerende transgener af særlig interesse med hensyn til genteknologi af OVs. Målrettet udtryk for sådanne genprodukter af OV-inficerede tumorceller reducerer toksicitet i forhold til systemisk administration. Målretning opnås enten ved hjælp af vira med iboende oncoselectivity eller ved at ændre virale tropisme8. Lokale immunomodulation forbedrer de mangesidede anti-tumor mekanismer af OVT. Denne strategi er desuden medvirkende til spørgekriterierne samspillet mellem vira, tumorceller og vært immunsystemet. Med henblik herpå giver denne protokol en gældende og justerbar workflow til at designe, klone, redde, udbrede og validere oncolytic paramyxovirus (specielt mæslingevirus) vektorer kodning sådan transgener.
Graduering af immunresponset kan opnås ved en bred vifte af transgene produkter rettet mod forskellige trin af kræft-immunitet cyklus9, herunder styrkelse af tumor antigen anerkendelse [fx tumor-associerede antigener (TAAs) eller induktorer af store histocompatibility complex (MHC) klasse i molekyler] over støtte dendritiske celle modning for effektiv antigen præsentation (cytokiner); rekruttering og aktivering ønskede immunceller som cytotoksiske og hjælper T-celler [kemokiner, bispecific T-celle ager (BTEs)]; målretning smittespredningshæmmende celler som regulerende T-celler, myeloid-afledte suppressor celler, tumor-associerede makrofager og kræft-associerede fibroblaster (antistoffer, BTEs, cytokiner); og forebyggelse af effektor celler hæmning og udmattelse (checkpoint hæmmere). Således, en overflod af biologiske agenser er tilgængelige. Evaluering af sådanne virus-kodet hæmmende vedrørende terapeutiske virkning og mulige synergier samt forståelse af respektive mekanismer er nødvendigt at forbedre kræftbehandling.
Negativ forstand enkeltstrenget RNA-vira af familien Paramyxoviridae er kendetegnet ved flere funktioner bidrager til deres anvendelse som oncolytic vektorer. Disse omfatter en naturlig oncotropism, stor genomisk kapacitet for transgener (mere end 5 kb)10,11, effektiv spredning, herunder syncytia dannelse og høj immunogenicitet12. Derfor, OV platforme baseret på canine distemper virus13, fåresyge virus14, Newcastle disease virus15, Sendai virus16,17, simian virus 518og Tupaia paramyxovirus19 er blevet udviklet. De mest fremtrædende, live svækkede mæslinger virus vaccine stammer (MV) er kommet i prækliniske og kliniske udvikling20,21. Disse virusstammer har været anvendt i årtier for rutinemæssig immunisering med en fremragende sikkerhed post22. Derudover er der ingen risiko for pattedyrsceller mutagenese på grund af den strengt cytosole replikering af paramyxovirus. En alsidig omvendt genetik system baseret på anti-genomisk cDNA, der giver mulighed for indsættelse af transgener i yderligere transskription enheder (ATUs) er tilgængelige11,23,24. MV vektorer kodning natrium-Iodid symporter (MV-NIS) til billedbehandling og strålebehandling eller opløselige carcioembryonisk antigen (MV-CEA) som en surrogat markør for viral genekspression evalueres i øjeblikket i kliniske forsøg (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 og NCT00408590). Sikker administration er blevet bekræftet og har indberettet tilfælde af anti-tumor effekt i tidligere undersøgelser25,26,27,28,29, 30 (gennemgået af Msaouel et al.31), baner vejen for yderligere oncolytic mæslinger vira, der er blevet udviklet og testet preclinically. MV kodning immunmodulerende molekyler rettet mod forskellige trin af kræft-immunitet cyklus har vist sig at forsinke tumorvækst og/eller forlænge overlevelsen i mus, med dokumentation for immun-medieret effekt og langsigtede beskyttende immun hukommelse i syngeneic musemodeller. Vektor-kodet transgener omfatter granulocyt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF)32,33, H. pylori aktivering af neutrofile protein34, immun checkpoint hæmmere35, interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37og BTEs38, som krydse-link en tumor overflade antigen med CD3 og dermed fremkalde anti-tumor aktivitet af polyklonale T celler, uanset T-celle receptoren specificitet og co stimulation ( Figur 1). De lovende prækliniske resultater opnået for disse konstruktioner efterspørgslen yderligere translationel indsats.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), en type jeg herpes simplex virus kodning GM-CSF, er den eneste oncolytic terapeutiske godkendt af de Forenede Stater mad og Drug Administration (FDA) og det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA). Fase III undersøgelse fører til godkendelser i slutningen 2015 har ikke kun vist effekt i stedet for samhandel tumorsygdomme injektion, men også abscopal effekter (dvs. remissioner af ikke-indsprøjtning læsioner) i avanceret melanom39. T-VEC har siden indgået yderligere forsøg for anvendelse i andre tumor enheder (f.eks., ikke-melanom hudkræft, NCT03458117, kræft i bugspytkirtlen, NCT03086642) og for evaluering af Kombinationsbehandlinger, især med immun checkpoint hæmmere (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 og Ribas et al.40).
Det viser ikke kun potentialet i oncolytic immunterapi, men også behovet for yderligere forskning for at identificere superior kombinationer af OVT og immunomodulation. Rationelt design af yderligere vektorer og deres udvikling til præklinisk afprøvning er nøglen til denne virksomhed. Dette vil også fremme forståelse af de underliggende mekanismer og har betydning for progression mod mere personlig kræftbehandling. Med henblik herpå præsenterer denne publikation metoden til ændring og udvikling af paramyxovirus for målrettede cancer immunterapi og mere specifikt af oncolytic mæslinger virus kodning T-celle-engagerende antistoffer (figur 2).
Oncolytic immunterapi (dvs.., OVT i kombination med immunomodulation) holder meget lovende til behandling af cancer, kræver yderligere udvikling og optimering af oncolytic virus kodning immunmodulerende proteiner. Denne protokol beskriver metoder til at generere og validere sådanne vektorer til efterfølgende test i relevante prækliniske modeller og potentielle fremtidige kliniske oversættelse til nye anti-cancer terapi.
Mange forskellige oncolytic virus platforme med forskellige …
The authors have nothing to disclose.
Disse metoder blev etableret i gruppen Virotherapy, ledet af Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts på det nationale Center for Tumor sygdomme i Heidelberg. Vi står i gæld til ham og alle medlemmer af teamet laboratorium især Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler og Jessica Albert. Dette arbejde blev støttet af andet Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 til C.E. Engeland) og tysk National Science Foundation (DFG, give C.E. Engeland da 1119/2-1). J.P.W. Heidbuechel modtager et stipendium af Helmholtz International Graduate School for kræftforskning.
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit | Roche Life Science, Mannheim, Germany | 4898117001 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A9539-500G | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 28704 | |
NEB 10-beta Competent E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | C3019I | |
LB medium after Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X964.1 | |
Ampicillin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HP62.1 | |
QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 27104 | |
Restriction enzyme HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | R3104S | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | |
FugeneHD | Promega, Mannheim, Germany | E2311 | may be replaced by transfection reagent of choice |
Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | K0129 | |
Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | available upon request | |
Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Germany | ACC 342 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | |
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Germany | PK-CA20-300-1000 | includes XTT reagent |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 14190-094 | |
QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, Hilden, Germany | 31014 | |
Sodium chloride | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.3 | |
Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Germany | UFC901024 | |
BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I4506 | |
Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 555749 | RRID: AB_396091 |
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-090-485 | |
MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
RIPA buffer | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega, Mannheim, Germany | G1780 | includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution |
Cell lifter | Corning, Reynosa, Mexico | 3008 | |
10 cm dishes | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 | |
15 cm dishes | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 639160 | |
96-well plates, U-bottom | TPP, Trasadingen, Switzerland | 92097 | |
96-well plates, flat bottom | Neolab, Heidelberg, Germany | 353072 | |
6-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353046 | |
12-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353043 | |
50 mL tubes | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany | 02-572-3001 | |
T175 cell culture flasks | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
0.22 µm filters | Merck, Darmstadt, Germany | SLGPM33RS |