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Recherche en cancérologie

Paramyxoviruses per l'immunomodulazione mirata tumore: progettazione e valutazione Ex Vivo

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58651
,
1Department of Translational Oncology,German Cancer Research Center (DKFZ) and National Center for Tumor Diseases (NCT), 2Faculty of Biosciences,Heidelberg University, 3Department of Medical Oncology,NCT and Heidelberg University Hospital

Summary

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.

Abstract

Immunoterapia del cancro di successo ha il potenziale per raggiungere il controllo a lungo termine del tumore. Nonostante recenti successi clinici, ci rimane un urgente bisogno di terapie sicure ed efficaci su misura per profili immune tumore specifico. Virus oncolitici abilitare l’induzione delle risposte immunitarie antitumorali come pure l’espressione genica del tumore limitato. Questo protocollo descrive la generazione ed ex vivo analisi di immunomodulatori oncolytic vettori. Concentrandosi sui virus vaccino morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio, la metodologia generale può essere adattata ad altre specie del virus e transgeni. Il flusso di lavoro presentato comprende la progettazione, clonazione, salvataggio e propagazione di virus ricombinanti. Saggi per analizzare la cinetica di replica e l’attività litica del vettore così come funzionalità dell’immunomodulatore isolato ex vivo sono inclusi, facilitando così la generazione di nuovi agenti per un ulteriore sviluppo in modelli preclinici e, infine, traduzione clinica.

Introduction

Virus oncolitici (OVs) stanno sviluppandi come terapie anti-cancro che specificamente replicano all’interno e uccidere le cellule tumorali mantenendo intatti i tessuti sani. Esso è ormai diventato comune comprensione che Oncolitica oncolytic (OVT), nella maggior parte dei casi, non affidarsi esclusivamente alla lisi completa del tumore replica efficiente e la diffusione del virus, ma richiede ulteriori meccanismi di azione per il successo del trattamento, tra cui vascolare e stromal di targeting e, soprattutto, stimolazione immune1,2,3,4. Mentre molti primi OV studi utilizzati virus non modificato, la ricerca attuale ha beneficiato di un biologico una migliore comprensione, biobanche di virus potenzialmente contenenti romanzo OVs e le possibilità offerte dall’ingegneria genetica al fine di creare avanzati OV piattaforme5,6,7.

Dato il recente successo di immunoterapia, immunomodulatori transgeni sono di particolare interesse per quanto riguarda l’ingegneria genetica di OVs. Espressione di tali prodotti genici dalle cellule del tumore OV-infetti riduce la tossicità rispetto alla somministrazione sistemica. Targeting è ottenuto utilizzando virus con oncoselectivity inerente o modificando tropismo virale8. Immunomodulazione locale migliora i meccanismi anti-tumorali multi-sfaccettati di OVT. Inoltre, questa strategia è fondamentale per interrogare l’interazione tra virus, le cellule del tumore e il sistema immunitario dell’ospite. A tal fine, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro applicabile e regolabile per progettare, clonare, salvataggio, propagare e convalidare oncolytic vettori di paramixovirus (specificamente il virus del morbillo) codifica tali transgeni.

Modulazione della risposta immunitaria può essere raggiunto da un’ampia varietà di prodotti di transgene targeting diverse fasi del cancro-immunità ciclo9, tra cui migliorare il riconoscimento dell’antigene tumorale [ad es., antigeni tumore-associati (TAA) o induttori del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I molecole] sopra la maturazione delle cellule dendritiche di supporto per la presentazione dell’antigene efficiente (citochine); reclutamento e l’attivazione di cellule immunitarie desiderate come citotossici e cellule helper T [chemochine, anticorpo cellula T Ager (retroauricolari)]; targeting soppressive cellule come cellule T regolatorie, cellule mieloidi-derivato del soppressore, macrofagi associati al tumore e cancro-collegati di fibroblasti (anticorpi, retroauricolari, citochine); e prevenire l’inibizione delle cellule effettrici ed esaurimento (inibitori di checkpoint). Così, una pletora di agenti biologici è disponibile. Valutazione di tali immunomodulatori virus-messo per quanto riguarda l’efficacia terapeutica e possibili sinergie, nonché la comprensione dei rispettivi meccanismi è necessaria per migliorare la terapia del cancro.

Virus del RNA singolo filamento senso negativo della famiglia Paramyxoviridae sono caratterizzati da diverse caratteristiche favorevoli al loro uso come vettori oncolytic. Questi includono un oncotropism naturale, di grande capacità genomico per transgeni (più di 5 kb)10,11, efficiente diffusione compreso formazione di sincizi e alta immunogenicità12. Di conseguenza, le piattaforme OV basate sul cimurro virus13, parotite virus14, Newcastle malattia virus15, Sendai virus16,17, simian virus 518e Tupaia paramyxovirus19 sono stati sviluppati. Più visibile, attenuato vaccino vivo del morbillo virus ceppi (MV) hanno progredito in sviluppo preclinico e clinico20,21. Questi ceppi sono stati utilizzati per decenni per immunizzazione di routine con un record di sicurezza eccellente22. Inoltre, non c’è nessun rischio di mutagenesi inserzionale dovuto la replica rigorosamente citosolica di paramyxoviruses. Un sistema versatile di genetica inversa basato su cDNA anti-genomico che consente per l’inserimento dei transgeni in unità trascrizionali aggiuntive (ATUs) è disponibili11,23,24. Vettori di MV codifica symporter ioduro di sodio (MV-NIS) per imaging e radioterapia o antigene carcinoembrionario solubile (MV-CEA) come un indicatore sostitutivo per l’espressione genica virale sono attualmente in fase di valutazione in studi clinici (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 e NCT00408590). Amministrazione provvisoria è stata confermata e sono stati segnalati casi di efficacia anti-tumorale in precedenti studi25,26,27,28,29, 30 (Recensito da Msaouel et altri.31), spianando la strada alla ricerca di virus di morbillo oncolytic aggiuntivi che sono stati sviluppati e testati preclinically. MV codifica immunomodulatori molecole targeting diverse fasi del ciclo del cancro-immunità hanno dimostrati di rallentare la crescita del tumore e/o prolungare la sopravvivenza in topi, con prova per efficacia di immune-mediata e memoria immunitaria protettiva a lungo termine in syngeneic modelli murini. Vettore-codificato transgeni includono fattore (GM-CSF)32,33, H. pylori neutrofilo-attivazione proteina34, checkpoint immuni inibitori35, di stimolazione della Colonia del granulocyte-macrofago interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37e retroauricolari38, che legame incrociato un antigene di superficie del tumore con CD3 e indurre così attività anti-tumorale di cellule T policlonali, indipendentemente dalla T cell receptor specificità e co-stimolazione ( Figura 1). I risultati preclinici promettenti ottenuti per questi costrutti ulteriori sforzi traslazionale domanda.

Talimogene laherparepvec (T-VEC), un tipo ho herpes simplex virus codifica GM-CSF, è l’unico oncolytic terapeutico approvato dalla United States Food e Drug Administration (FDA) e Agenzia europea dei medicinali (EMA). Studio di fase III che conduce a omologazioni in fine del 2015 non ha solo dimostrato efficacia al luogo dell’iniezione intra-tumorali, ma anche effetti abscopal (cioè, le remissioni delle lesioni non-iniettato) nel melanoma avanzato39. T-VEC da allora è entrato prove supplementari per applicazione in altre entità del tumore (ad esempio tumori cutanei non-melanoma di, , NCT03458117; cancro del pancreas, NCT03086642) e per la valutazione delle terapie di combinazione, specialmente con checkpoint immuni inibitori (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 e Ribas et altri.40).

Ciò dimostra non solo il potenziale di immunoterapia oncolytic, ma anche la necessità di ulteriori ricerche identificare le combinazioni superiori di OVT e immunomodulazione. Progettazione razionale di ulteriori vettori e loro sviluppo per test preclinici è chiave per questa impresa. Questo avanzerà anche la comprensione dei meccanismi di fondo e ha implicazioni per la progressione verso il trattamento del cancro più personalizzata. A tal fine, questa pubblicazione presenta la metodologia per la modifica e lo sviluppo del paramyxoviruses per immunoterapia del cancro mirate e, più in particolare, del virus di morbillo oncolitici codifica anticorpi impegnandosi a cellula T (Figura 2).

Protocol

Nota: [O], [P] e [M] indicare applicabili alle sottosezioni: OVs in generale, paramyxoviruses (la maggior parte) o MV solo, rispettivamente. [B] indica le sezioni specifiche per BTE transgeni. 1 clonazione dei transgeni immunomodulatore-codifica in vettori del Virus di morbillo [O] design inserire sequenza. [O] decidere un immunomodulatore di interesse basato su ricerca di letteratura o esplorativa dei dati quali schermi genetici<sup class…

Representative Results

La figura 1 illustra il meccanismo di azione del virus di morbillo oncolitici codifica anticorpo cellula T ager. Un diagramma di flusso che descrive il flusso di lavoro del presente protocollo è presentato nella Figura 2. Figura 3 Mostra un esempio di un genoma di virus di morbillo oncolytic modificate. Questo fornisce una rappresentazione visiva dei cambiamenti specifici applicati…

Discussion

L’immunoterapia oncolytic (vale a dire., OVT in combinazione con immunomodulazione) rappresenta una grande promessa per il trattamento del cancro, chiedendo ulteriori sviluppo e ottimizzazione di virus oncolitici codifica proteine immunomodulatori. Questo protocollo descrive i metodi per generare e convalidare tali vettori per la prova successiva in modelli preclinici rilevanti e potenziale futuro traduzione clinica in nuove terapie anti-cancro.

Numerose piattaforme di virus oncolytic…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questi metodi sono stati stabiliti nel gruppo Oncolitica guidato dal Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts presso il centro nazionale per patologie tumorali a Heidelberg. Siamo grati a lui e tutti i membri del team di laboratorio, soprattutto Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler e Jessica Albert. Questo lavoro è stato supportato dall’altro Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 al C.E. Engeland) e la Fondazione di scienza nazionale tedesca (DFG, concedere EN 1119/2-1 al C.E. Engeland). J.P.W Heidbuechel riceve uno stipendio da Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

Materials

Rapid DNA Dephos & Ligation Kit Roche Life Science, Mannheim, Germany 4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot K1231
Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden, Germany 28704
NEB 10-beta Competent E. coli New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany C3019I
LB medium after Lennox Carl Roth, Karlsruhe, Germany X964.1
Ampicillin Carl Roth, Karlsruhe, Germany HP62.1
QIAquick Miniprep Kit QIAGEN, Hilden, Germany 27104
Restriction enzyme HindIII-HF New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany R3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen, Darmstadt, Germany 31966-021
Fetal bovine serum (FBS) Biosera, Boussens, France FB-1280/500
FugeneHD Promega, Mannheim, Germany E2311 may be replaced by transfection reagent of choice
Kanamycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany K0129
Vero cells ATCC, Manassas, VA, USA CCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg available upon request
Granta-519 DSMZ, Braunschweig, Germany ACC 342
Opti-MEM (serum-free medium) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) PromoKine, Heidelberg, Germany PK-CA20-300-1000 includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin Columns QIAGEN, Hilden, Germany 31014
Sodium chloride Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.3
Imidazole Carl Roth, Karlsruhe, Germany I5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa Merck, Darmstadt, Germany UFC901024
BCA Protein Assay Kit Merck Milipore 71285-3
IgG from human serum Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I4506
Anti-HA-PE Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-257 RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody BD Biosciences, Heidelberg, Germany 555749 RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 12158167001 RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-090-485
MS Columns Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
MiniMACS Separator Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-303
RIPA buffer Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA MB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega, Mannheim, Germany G1780 includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifter Corning, Reynosa, Mexico 3008
10 cm dishes Corning, Oneonta, NY, USA 430167
15 cm dishes Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 639160
96-well plates, U-bottom TPP, Trasadingen, Switzerland 92097
96-well plates, flat bottom Neolab, Heidelberg, Germany 353072
6-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353046
12-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353043
50 mL tubes nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany 02-572-3001
T175 cell culture flasks Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot 159910
0.22 µm filters Merck, Darmstadt, Germany SLGPM33RS
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Citer Cet Article
Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (143), e58651, doi:10.3791/58651 (2019).
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