Det här protokollet beskriver en detaljerad arbetsflöde för generering och ex vivo karakterisering av onkolytisk virus för uttryck av immunomodulatorer, med mässlingvirus kodning bispecific T cell engagers som exempel. Ansökan och anpassning till andra vektor plattformar och transgener kommer att påskynda utvecklingen av nya immunovirotherapeutics för kliniska översättning.
Framgångsrika cancer immunoterapi har potential att uppnå långsiktig tumör kontroll. Trots senaste kliniska framgångar återstår det ett brådskande behov av säkra och effektiva behandlingar som skräddarsys individuella tumör immun profiler. Onkolytisk virus aktiverar induktion av anti-tumor immunsvar samt tumör begränsad genuttryck. Det här protokollet beskriver den generation och ex vivo analysen av immunmodulerande onkolytisk vektorer. Fokusera på mässling vaccinvirus kodning bispecific T cell engagers som ett exempel, kan allmän metod anpassas till andra virus arter och transgener. Presenterade arbetsflödet innehåller design, kloning, räddning, och förökningen av rekombinanta virus. Analyser att analysera replikering kinetik och lytisk aktivitet av vektor samt funktionaliteten i den isolerade immunmodulerande ex vivo ingår, vilket underlättar generationen av romanen agenter för vidareutveckling i prekliniska modeller och slutligen kliniska översättning.
Onkolytisk virus (OVs) utvecklas som mot cancer therapeutics som specifikt replikera inom och döda tumörceller medan frisk vävnad intakt. Det har nu blivit vanligt förstå att onkolytisk virotherapy (ÖVT), i de flesta fall, förlitar sig inte enbart på komplett tumör lysis genom effektiv replikering och sprider viruset, men kräver ytterligare verkningsmekanismer för behandlingframgång, inklusive vaskulära och stromal inriktning och allt immun stimulering1,2,3,4. Medan många tidiga OV studier används omodifierade virus, har aktuell forskning gynnats av en förbättrad biologisk förståelse, virus biobanker som potentiellt innehåller roman OVs, och de möjligheter som erbjuds av genteknik för att skapa avancerade OV plattformar5,6,7.
Med tanke på den senaste tidens framgången immunterapi, är immunmodulerande transgener av särskilt intresse när det gäller gentekniken av OVs. Riktade uttryck för sådana genprodukter av OV-infekterad tumörceller minskar toxicitet jämfört med systemisk administrering. Inriktning uppnås antingen genom att använda virus med inneboende oncoselectivity eller genom att ändra viral tropism8. Lokala immunmodulering förbättrar OVT mångfacetterade anti-tumor mekanismer. Denna strategi är dessutom instrumental i förhör samspelet mellan virus, tumörceller och värd immunsystemet. Därför ger detta protokoll ett tillämpligt och justerbar arbetsflöde för att designa, klona, rädda, propagera och validera onkolytisk paramyxovirus (specifikt mässlingvirus) vektorer kodning sådan transgener.
Modulering av immunsvaret kan uppnås genom ett brett utbud av transgenens produkter inriktning olika steg av cancer-immunitet cykel9, inklusive förbättra tumör antigen erkännande [t.ex. tumör-associerade antigener (TAAs) eller inducerare av stora histocompatibility komplex (MHC) klass I molekyler] över stödja dendritiska cellen mognad för effektiv antigen-presentation (cytokiner); rekrytera och aktivera önskad immunceller som cytotoxiska och helper T-celler [chemokiner, bispecific T cell engagers (bö)]; inriktning suppressiv celler regulatoriska T-celler, myeloid-derived suppressor, tumör-associerad makrofager, och cancer-associerade fibroblaster (antikroppar, bö, cytokiner); och förhindra effektor celler hämning och utmattning (checkpoint-hämmare). Således finns en uppsjö av biologiska agens. Det är nödvändigt att förbättra cancerbehandling utvärdering av sådana virus-kodade immunomodulatorer angående terapeutisk effekt och eventuella synergieffekter samt förståelse av respektive mekanismer.
Negativ bemärkelse enkelsträngat RNA-virus av familjen Paramyxoviridae kännetecknas av flera funktioner bidrar till deras användning som onkolytisk vektorer. Dessa inkluderar en naturlig oncotropism, stor genomisk kapacitet för transgener (mer än 5 kb)10,11, effektiv spridning inklusive syncytia bildning och hög immunogenicitet12. Därför OV plattformar baserade på valpsjuka virus13, påssjuka virus14, Newcastle sjukdom virus15, Sendai virus16,17, simian virus 518och Tupaia paramyxovirus19 har utvecklats. Mest framträdande, levande försvagat mässlingvirusvaccin stammar (MV) har utvecklats i preklinisk och klinisk utveckling20,21. Dessa virusstammar har använts i decennier för rutin immunisering med en utmärkt säkerhet rekord22. Dessutom finns det ingen risk för insertionsmutationer på grund av strikt cytosoliska replikering av paramyxovirus. En mångsidig omvänd genetik system baserat på anti genomisk cDNA som möjliggör införande av transgener i ytterligare transkription enheter (ATUs) är tillgängliga11,23,24. MV vektorer kodning natriumjodid symporter (MV-NIS) för imaging och strålbehandling eller lösliga carcinoembryonalt antigen (MV-CEA) som surrogatmarkör för viral genuttryck utvärderas för närvarande i kliniska prövningar (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 och NCT00408590). Säker administration har bekräftats och anti-tumör effekt har rapporterats i tidigare studier25,26,27,28,29, 30 (granskas av Msaouel et al.31), bana väg för ytterligare onkolytisk mässlingvirus som har utvecklats och testats prekliniskt. MV kodning immunmodulerande molekyler inriktning olika steg av cancer-immunitet cykeln har visat sig fördröja tumörens tillväxt och/eller förlänga överlevnaden hos möss, med bevis för immunmedierade effekt och långsiktiga skyddande immunologiskt minne i syngena mus-modeller. Vektor-kodade transgener inkluderar granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF)32,33, H. pylori neutrofiler-aktiverande protein34, immun checkpoint-hämmare35, interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37och BTEs38, som tvärbinda en tumör ytantigen med CD3 och därmed framkalla antitumöraktivitet av polyklonala T-celler, oavsett T-cell receptor specificitet och samtidig stimulering ( (Se figur 1). Lovande prekliniska resultaten för dessa konstruktioner efterfrågan ytterligare translationell insatser.
Talimogen laherparepvek (T-VEC), en typ jag herpes simplex-virus kodning GM-CSF, är den enda onkolytisk terapeutiska godkänd av amerikanska Food och Drug Administration (FDA) och Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA). I fas III-studie som leder till godkännanden i slutet av 2015 har inte bara visat effekt på platsen för intra-tumoral injektion, men även abscopal effekter (dvs remissioner av icke-injicerade lesioner) i avancerat melanom39. T-VEC har sedan dess trätt ytterligare prövningar för tillämpning i andra tumör enheter (t.ex., icke-melanom hudcancer, NCT03458117, pankreascancer, NCT03086642) och för utvärdering av kombinationsbehandlingar, särskilt med immun checkpoint hämmare (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 och Ribas et al.40).
Detta visar inte bara potentialen i onkolytisk immunterapi men också behovet av ytterligare forskning för att identifiera överlägsen kombinationer av OVT och immunmodulering. Rationell design ytterligare vektorer och utveckling för preklinisk testning är nyckeln till detta åtagande. Detta kommer också förväg förståelse för bakomliggande mekanismer och konsekvenser för utvecklingen mot mer personlig cancerbehandling. Därför presenterar denna skrift en metod för en modifiering och utveckling av paramyxovirus för riktade cancer immunoterapi och mer specifikt av onkolytisk mässlingvirus kodning T cell-engagerande antikroppar (figur 2).
Onkolytisk immunterapi (i.e., OVT i kombination med immunmodulering) innehar stort löfte för cancerbehandling, kräver ytterligare utveckling och optimering av onkolytisk virus kodning immunmodulerande proteiner. Det här protokollet beskriver metoder för att generera och verifiera sådana vektorer för efterföljande testning i relevanta prekliniska modeller och potentiella framtida kliniska översättning till romanen mot cancer therapeutics.
Många olika onkolytisk virus plattfo…
The authors have nothing to disclose.
Dessa metoder var etablerade i gruppen Virotherapy som leds av Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts vid National Center för tumörsjukdomar i Heidelberg. Vi står i skuld till honom och alla medlemmar i laboratoriet laget, särskilt Dr Tobias Speck, Dr Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler, och Jessica Albert. Detta arbete fick stöd av den annan Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 till C.E. Engeland) och tyska National Science Foundation (DFG, bevilja C.E. Engeland sv 1119/2-1). J.P.W. Heidbuechel får ett stipendium av Helmholtz internationella forskarskolan för cancerforskning.
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit | Roche Life Science, Mannheim, Germany | 4898117001 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A9539-500G | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 28704 | |
NEB 10-beta Competent E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | C3019I | |
LB medium after Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X964.1 | |
Ampicillin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HP62.1 | |
QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 27104 | |
Restriction enzyme HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | R3104S | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | |
FugeneHD | Promega, Mannheim, Germany | E2311 | may be replaced by transfection reagent of choice |
Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | K0129 | |
Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | available upon request | |
Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Germany | ACC 342 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | |
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Germany | PK-CA20-300-1000 | includes XTT reagent |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 14190-094 | |
QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, Hilden, Germany | 31014 | |
Sodium chloride | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.3 | |
Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Germany | UFC901024 | |
BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I4506 | |
Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 555749 | RRID: AB_396091 |
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-090-485 | |
MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
RIPA buffer | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega, Mannheim, Germany | G1780 | includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution |
Cell lifter | Corning, Reynosa, Mexico | 3008 | |
10 cm dishes | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 | |
15 cm dishes | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 639160 | |
96-well plates, U-bottom | TPP, Trasadingen, Switzerland | 92097 | |
96-well plates, flat bottom | Neolab, Heidelberg, Germany | 353072 | |
6-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353046 | |
12-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353043 | |
50 mL tubes | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany | 02-572-3001 | |
T175 cell culture flasks | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
0.22 µm filters | Merck, Darmstadt, Germany | SLGPM33RS |