Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서
Summary
Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.
Abstract
면역 반응 조절에 그들의 중요 한 역할 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 대상이 되고있다 하 고 자가 면역 질환, 동맥 경화, 암 등 여러 질환에 유망한 치료 대상 대표. 프로브; 대 식 세포 기능을 조작 하는 선택의 귀중 한 접근은 RNAi 중재 한 유전자 침묵 그러나, siRNA와 대 식 세포의 transfection 종종 기술적으로 도전으로 간주 하 고, 현재, 대 식 세포를 siRNA 전송에 전념 하는 몇 가지 방법론을 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 siRNA의 세포 타겟된 배달에 대 한 차량으로 polyethyleneimine 코팅 superparamagnetic 철 산화물 나노 입자 (페이-SPIONs)를 사용 하 여 프로토콜을 제시. PEI SPIONs 바인딩 및 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 완전히 siRNA를 콘 덴 싱의 고 위에 할 수 있다. 생체 외에서이러한 나노 수 효율적으로 제공 siRNA transfection에 대 한 최적의 복용량에서 손상 세포 생존 능력 없이 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 라인에 뿐만 아니라 기본 세포로 하 고, 궁극적으로, 그들은 유도 siRNA 중재 대상 유전자 침묵입니다. SiRNA transfection 생체 외에서 사용 되 고, 떨어져 페이 SPIONs 세포에서 vivo에서를 siRNA를 제공 하기 위한 유망한 도구 있습니다. 자기적 성질 및 유전자 침묵 능력의 결합된 기능에 비추어 체계적으로 관리 페이-스파이/siRNA 입자 뿐만 아니라 대 식 세포 기능 조절 뿐만 아니라 몇 군데를 추적 세포 활성화 예상 된다. 페이-SPIONs 대 식 세포를 siRNA 전달, 안전, 간단 하 고 효과적인 nonviral 플랫폼을 대표 하는 본질적으로, 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.
Introduction
대 식 세포는 다른 금액에도 불구 하 고 모든 신체 조직에 배포 하는 타고 난 면역 세포의 유형입니다. 생산 함으로써 다양 한 cytokines 및 다른 중재자, 그들은 중요 한 역할을 재생 하는 미생물 병원 체 침입에 대 한 호스트 방어, 다음 부상, 조직 복구 및 조직의 항상성1를 유지 하. 그들의 중요성 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 주제 되었습니다 합니다. 그러나, 유전자 조절 및 기능 연구에 있는 그것의 보급에도 불구 하 고 중재 하는 siRNA 유전자 침묵은 대 식 세포 때문에 성공 가능성이 이러한 셀-특히, 주 대 식 세포-는 종종 transfect 어렵다. 이 독성 연관 있는 세포 막 화학은 가장 잘 설립 transfection 접근 (예를 들면, 고분자와 지질)의 상대적으로 높은 수준의 관찰 작용 수 있다 또는 육체적으로 (예를 들어, electroporation 여 고 유전자 총) 교차 하는 그로 인하여 크게 줄이고 세포의 생존2,3막 siRNA 분자를 방해 합니다. 또한, 대 식 세포는 전용된 phagocytes degradative 효소 풍부. 이러한 효소 siRNA, 유전자 특정 siRNA의 셀3,4로 전달 하는 경우에 그 입을 효율성 약화의 무결성을 손상 수 있습니다. 따라서, 효과적인 macrophage 대상으로 siRNA 전달 시스템 납품4siRNA의 안정성과 무결성을 보호 하기 위해 필요 합니다.
역 기능 세포 개시와 자가 면역 질환, 동맥 경화, 고 암 같은 특정 일반적인 임상 질환의 진행에 연루는 점점 더 분명 하다. 이러한 이유로, 대 식 세포 기능을, 예를 들어, siRNA, 변조 치료 이러한 장애5,,67에 대 한 매력적인 방법론으로 신흥 되었습니다. 많은 진행 했다, siRNA 기반 치료 전략의 주요 과제는 체계적으로 관리 siRNA와 대 식 세포, 따라서 원치 않는 부작용으로 이어질에 의해 부족 한 siRNA 통풍 관의 불 쌍 한 세포 특이성. 일반적으로 최적의 셀 선택도 부족 하 고 종종 오프 대상 부작용, 약물 로드 (NPs), 나노의 reticuloendothelial 시스템에 의해 점령 되 고 그들의 자발적인 성향 때문으로 이어질 무료 핵 산 치료제와 비교 수동 타겟팅 세포에 vivo에서, 최소한의 부작용8향상 된 치료 효능에 대 한 수 있도록 설계 될 수 있다. 현재 NPs RNA 분자의 배달에 대 한 탐험 등 무기 nanocarriers, 다양 한 리, 고분자9. 그 중 polyethyleneimine (페이), 양이온 고분자 바인딩 및 안정된 NPs로 집 광 하는 핵 산의 종류 용량9,10를 제공 하는 가장 높은 RNA를 보여줍니다. 페이, 세포 막에 걸쳐 그들의 전송을 중재 및 그들의 세포내 방출 촉진 효소와 nonenzymatic 저하에서 핵 산을 보호 한다. 비록 처음 DNA 배달 시 약으로 도입, 페이 이후에 로컬 하나 siRNA 전달 vivo에서 또는 체계적으로9,10매력적인 플랫폼으로 시연 했다.
Superparamagnetic 산화 철 나노 입자 (SPIONs) 생물의 약, 그들의 자기 특성, 생체 적합성, 생물학으로 중요 한 개체, 높은 표면 지역에 양 비율에 비해 크기 때문에 큰 약속을 보여왔다 고 쉽게 적응 표면 bioagent 첨부 파일11. 예를 들어, 그들의 잠재적인 유틸리티 대조 대리인 및 대 식 세포에 의해 급속 한 통풍 관으로, 때문에 SPIONs 이미지 조직 대 식 세포12좋아하는 임상 도구로 떠오르고 있다. 문학에 대 한 캐리어로 SPIONs의 몇 가지 보고서가 포함 되어 동안 SPIONs 또한 광범위 하 게 연구 핵 산 배달 차량11,13,,1415, 우리의 지식, 대 식 세포를 대상으로 siRNA 전달입니다. SPIONs에 의해 유전자 배달에 대 한 그들의 표면은 일반적으로 친수성 양이온 폴리머는 부정적으로 위탁 된 핵 산 정전 끌었다 고 수 곁의 층으로 입힌 다. 여기, 우리가 그 표면 낮은 분자-무게 (10 kDa), 분기 페이 (PEI SPIONs) 수정 됩니다 SPIONs을 합성 하는 방법을 제시. 이러한 자기 nanoplatforms 다음 셀에 siRNA 전송 수 있도록 페이-스파이/siRNA 복합물을 형성 하는 siRNA를 압축 하는 채택 된다. 우리 reticuloendothelial 시스템16의 세포에 의해 SPIONs의 자발적인 먹어서 그 이유, 바인딩의 강한 능력이 함께 하 고 페이 SPIONs를 siRNA에의 효율적인 전송에 적합 렌더링 응축 핵 산 페이, 여 대 식 세포입니다. 여기에 제시 된 데이터 지원으로 문화 뿐만 아니라 vivo에서세포에 페이 스파이/siRNA-중재 된 유전자 침묵의 타당성.
Protocol
Representative Results
Discussion
대 식 세포는 일반적으로 사용 되 nonviral 접근, electroporation, 양이온 리 등 지질 종에 의해 transfect 내 화물. 여기 우리 transfect siRNA와 대 식 세포를 안정적이 고 효율적인 방법을 설명 합니다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, 이상 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 (그림 2B)와 쥐 복 막 대 식 세포18 의 90% 수 수 페 세포 생존 능력의 중요 한 장애 없이 siRNA와. 이 메서?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81772308)와 국가 핵심 연구 및 중국의 개발 프로그램 (No. 2017YFA0205502)에 의해 지원 되었다.
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
- Davignon, J. -. L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
