Vi beskriver en metod för att använda polyethyleneimine (PEI)-belagda superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar för transfecting makrofager med siRNA. Dessa nanopartiklar kan effektivt leverera siRNA att makrofager in vitro- och in-vivo och tystnad mål genuttryck.
På grund av sin kritiska roll i reglering av immunsvar, makrofager har kontinuerligt varit föremål för intensiv forskning och innebära en lovande terapeutiskt mål i många sjukdomar, såsom cancer, åderförkalkning och autoimmuna sjukdomar. RNAi-medierad nedtystning är en värdefull metod val sond och manipulera makrofag funktion; dock transfection av makrofager med siRNA anses ofta vara tekniskt utmanande, och för närvarande finns några metoder tillägnad siRNA överföring till makrofager. Här presenterar vi ett protokoll med polyethyleneimine-belagda superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar (PEI-SPIONs) som ett fordon för riktade leverans av siRNA till makrofager. PEI-SPIONs klarar av bindande och helt kondenserande siRNA när den Fe: siRNA viktförhållandet når 4 och ovan. In vitro, dessa nanopartiklar effektivt kan leverera siRNA primära makrofager, men även in i makrofag-liknande RAW 264,7 cell linje, utan att kompromissa med cellviabilitet på den optimala dosen för transfection, och, slutligen, de inducerar siRNA-medierad mål nedtystning. Frånsett används för in vitro- siRNA transfection, är PEI-SPIONs också en lovande verktyg för att leverera siRNA till makrofager i vivo. Med tanke på dess kombinerade funktioner av magnetiska egendom och nedtystning förmåga förväntas systemiskt administrerade PEI-DEMOLERADES/siRNA partiklar inte bara att modulera makrofag funktion, utan också att aktivera makrofager som ska avbildas och spåras. I huvudsak PEI-SPIONs representerar en enkel, säker och effektiv nonviral plattform för siRNA leverans till makrofager både in vitro- och in vivo.
Makrofager är en typ av medfödda immunceller som distribueras i alla kroppens vävnader, om än i olika mängder. Genom att producera en mängd cytokiner och andra mediatorer, spelar de avgörande roller i värd försvar mot invaderande mikrobiella patogener, i vävnad reparera efter skada och att upprätthålla vävnad homeostas1. På grund av sin betydelse, har makrofager kontinuerligt varit föremål för intensiv forskning. Men trots dess förekomst i genreglering och funktion studier, siRNA-medierad nedtystning är mindre sannolikt att lyckas i makrofager eftersom dessa celler — särskilt primära makrofager — är ofta svåra att transfect. Detta kan tillskrivas en relativt hög grad av toxicitet associerad med mest väletablerade transfection metoder där cellmembranet är kemiskt (t.ex., med polymerer och lipider) eller fysiskt (t.ex., av elektroporation och gen kanoner) stört för att låta siRNA molekyler korsa membranet, därmed drastiskt minska makrofager bärkraft2,3. Makrofager är dessutom dedikerad fagocyter rik på nedbrytningsvägar enzymer. Dessa enzymer kan skada integritet siRNA, försvaga dess tysta effektivitet även om gene-specifika siRNA har levererats till den cell3,4. En effektiv makrofag-riktade siRNA leveranssystem måste därför skydda integriteten och stabiliteten av siRNA under leverans4.
Det är alltmer uppenbart att dysfunktionella makrofager är inblandade i initiering och progression av vissa gemensamma kliniska sjukdomar som cancer, åderförkalkning och autoimmuna sjukdomar. Av denna anledning, modulerande makrofag funktion med, exempelvis siRNA, har trätt fram som en attraktiv metod för behandling av dessa sjukdomar5,6,7. Även om stora framsteg har gjorts, är en stor utmaning för siRNA-baserad behandlingsstrategi dålig cell specificitet systemiskt administrerade siRNA och otillräcklig siRNA upptaget av makrofager, som följaktligen leder till oönskade bieffekter. Jämfört med gratis nukleinsyra therapeutics som oftast saknar optimal cell selektivitet och ofta leder till biverkningar, drog-loaded nanopartiklar (NPs), på grund av deras spontana benägenhet av fångas upp av det retikuloendoteliala systemet, off-target kan vara konstruerad för passiv inriktning att makrofager i vivo, vilket möjliggör förbättrad terapeutisk effekt med minimal biverkningar8. Nuvarande NPs utforskade för leverans av RNA-molekyler är oorganiska nanocarriers, olika liposomer och polymerer9. Bland dem visar polyethyleneimine (PEI), en typ av katjoniska polymerer kan bindande och kondenserande nukleinsyror i stabiliserad NPs, den högsta RNA levererar kapacitet9,10. PEI skyddar nucleic syror från enzymatisk och nonenzymatic nedbrytning, förmedlar deras överföring över cellmembranet och främjar deras intracellulära release. Även om ursprungligen infördes som en DNA leverans reagens, visades därefter PEI för att vara en attraktiv plattform för i vivo siRNA delivery, antingen lokalt eller systemiskt9,10.
Superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar (SPIONs) har visat mycket lovande i biomedicin, på grund av deras magnetiska egenskaper, biokompatibilitet, jämförbar storlek till biologiskt viktiga objekt, hög yta-området-till-volym förhållande, och lätt att anpassa yta för bioagent bilaga11. Exempelvis på grund av deras potentiella nytta som kontrastmedel och snabbt upptag av makrofager dykt SPIONs upp som en favorit kliniska verktyg till bild vävnad makrofager12. Medan SPIONs har också studerats som nukleinsyra leverans fordon11,13,14,15, att vår kunskap, innehåller litteraturen några rapporter om SPIONs som bärare för makrofag-riktade siRNA delivery. För gen leverans av SPIONs, är deras yta oftast belagda med ett skikt av hydrofil katjoniska polymerer som negativt laddade nukleinsyror kan elektrostatiskt lockade och uppbundna. Här presenterar vi en metod för att syntetisera SPIONs vars yta är modifierad med låg molekylvikt (10 kDa), förgrenade PEI (PEI-SPIONs). Dessa magnetiska nanoplatforms anställs sedan kondensera siRNA, bildar PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex som aktiverar siRNA transport in i cellen. Vi anledning att spontan fagocytos av SPIONs av celler i det retikuloendoteliala system16, tillsammans med stark förmåga av bindande och kondenserande nukleinsyror av PEI, återger PEI-SPIONs lämplig för effektiv transport av siRNA in makrofager. De data som presenteras här stöder genomförbarheten av PEI-DEMOLERADES/siRNA-medierad nedtystning i makrofager i kultur samt i vivo.
Makrofager är refraktära mot transfect av vanliga nonviral tillvägagångssätt, såsom elektroporation, katjoniska liposomer och lipid arter. Här beskrivs vi en pålitlig och effektiv metod för att transfect makrofager med siRNA. Använder detta protokoll, kan över 90% av makrofag-liknande RAW 264,7 celler (figur 2B) och rat peritoneal makrofager18 vara transfekterade med siRNA utan betydande försämring av cellviabiliteten. Denna metod beror på plattformen PE…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av den National Natural Science Foundation i Kina (81772308) och nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (nr. 2017YFA0205502).
DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |