Her beskriver vi en metode til at vurdere lunge udtryk af miRNAs, der er forudsagt til at regulere inflammatoriske gener ved hjælp af mus udsættes for ozon eller filtreret luft på forskellige stadier af estrous cyklus.
MikroRNA (miRNA) profilering er blevet af interesse for forskere, der arbejder i forskellige områder af biologi og medicin. Aktuelle undersøgelser viser en lovende fremtid ved hjælp af miRNAs i diagnosticering og behandling af lungesygdomme. Her, definerer vi en protokol for miRNA profilering for at måle den relative forekomst af en gruppe af miRNAs forudsagt for at regulere inflammatoriske gener i lungevæv fra af en ozon-induceret luftvejs inflammation musemodel. Fordi det har vist sig at cirkulerende sex hormonniveauer kan påvirke reguleringen af lunge medfødt immunitet hos kvinder, er formålet med denne metode at beskrive en inflammatorisk miRNA profilering protokol i hunmus, under hensyntagen til estrous cyklus fase af hvert dyr på tidspunktet for ozon eksponering. Vi også behandle gældende Bioinformatik tilgange til miRNA opdagelse og målet identifikationsmetoder ved hjælp af limma, en R/Bioconductor software, og funktionel analyse software til at forstå de biologiske kontekst og veje i forbindelse med differential miRNA udtryk.
MicroRNA (miRNAs) er korte (19-25 nukleotider), naturligt forekommende, ikke-kodende RNA molekyler. Sekvenser af miRNAs er evolutionær bevaret på tværs af arter, hvilket tyder på betydningen af miRNAs i reguleringen af fysiologiske funktioner1. microRNA expression profilering har vist sig for at være nyttigt til at identificere miRNAs, der er vigtige i reguleringen af en række processer, herunder immunrespons, Celledifferentiering, udviklingsprocesser og apoptose2. Mere nylig, miRNAs er blevet anerkendt for deres potentielle anvendelse i sygdom diagnostik og terapi. For forskere at studere mekanismer af genregulering, kan måle miRNA udtryk oplyse systemer-niveau modeller af regulerende processer, især når miRNA oplysninger flettes med mRNA profilering og andre genom-skala data3. På den anden side miRNAs har også vist sig at være mere stabil end mRNAs i en vifte af modellen typer og er også målbare med større følsomhed end proteiner4. Dette har ført til betydelig interesse i udviklingen af miRNAs som biomarkører for forskellige molekylære diagnostiske programmer, herunder lungesygdomme.
I lungen spiller miRNAs vigtige roller i udviklingsprocesser og opretholdelsen af homøostase. Derudover har deres unormale udtryk været forbundet med udvikling og progression af forskellige lungesygdomme5. Inflammatorisk lungesygdom forårsaget af luftforurening har vist større sværhedsgrad og dårligere prognose hos kvinder, der angiver, at hormoner og estrous cyklus kan regulere lunge medfødt immunitet og miRNA udtryk som reaktion på miljømæssige udfordringer 6. i denne protokol, vi bruger ozon eksponering, som er en vigtig del af luftforureningen, for at fremkalde en form for lungebetændelse i hunmus, der opstår i mangel af adaptive immunitet. Ved hjælp af ozon, vi inducerende udviklingen af luftvejene hyperresponsivitet, der er forbundet med luftvejene epitelcelle skader og en stigning i neutrofile og inflammatoriske mediatorer i proksimale airways7. Der er i øjeblikket ikke velbeskrevet protokoller til at karakterisere og analysere miRNAs på tværs af estrous cyklus i ozon-eksponerede mus.
Nedenfor beskriver vi en simpel metode til at identificere estrous cyklus faser og miRNA udtryk i lungevæv af hunmus udsat for ozon. Vi tager også fat effektiv Bioinformatik tilgange til miRNA opdagelse og målet identifikation, med en vægt på computational biologi. Vi analyserer microarray data ved hjælp af limma, en R/Bioconductor software, der giver en integreret løsning til at analysere data fra gen expression eksperimenter8. Analyse af PCR array data fra limma har en fordel i forhold til magten over t-test baseret procedurer, når du bruger små antal arrays/prøver for at sammenligne udtryk. For at forstå biologiske forbindelse med miRNA udtryk resultater, brugte vi så funktionel analyse software. For at forstå de mekanismer, der regulerer transcriptional ændringer og forudsige sandsynlige udfald kombinerer softwaren miRNA-udtryk datasæt og viden fra litteratur9. Det er en fordel sammenlignet med software, bare kigge efter statistiske berigelse i overlappende sæt miRNAs.
MikroRNA profilering er en fordelagtig teknik til både klovesygediagnosticering og mekanistiske forskning. I dette manuskript definerede vi en protokol for at evaluere udtryk for miRNAs, der er forudsagt til at regulere inflammatoriske gener i lunger af hunmus udsat for ozon i forskellige estrous cyklus faser. Metoder til bestemmelse af estrous cyklus, som metoden visuel genkendelse har været beskrevet16. Men disse stole på engangs målinger, og derfor er upålidelige. Til præcist for at ident…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af tilskud fra NIH K01HL133520 (PS) og K12HD055882 (PS). Forfatterne takke Dr. Joanna Floros for assistance med ozon eksponering eksperimenter.
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
-80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |