Här beskriver vi en metod för att bedöma lung uttryck av MicroRNA som förutspås för att reglera inflammatoriska gener med möss utsätts för ozon eller filtrerad luft i olika skeden av östruscykel.
MikroRNA (miRNA) profilering har blivit intressant för forskare som arbetar inom olika forskningsområden av biologi och medicin. Aktuella studier visar en lovande framtid använda MicroRNA för diagnos och vård av lungsjukdomar. Här definierar vi ett protokoll för miRNA profilering för att mäta det relativa överflödet av en grupp av MicroRNA förutspådde för att reglera inflammatoriska gener i lungvävnad från av en ozon-inducerad luftvägarna inflammation musmodell. Eftersom det har visats att cirkulerande könshormon nivåer kan påverka regleringen av lung medfödd immunitet hos honor, är syftet med denna metod att beskriva en inflammatorisk miRNA profilering protokollet hos honmöss, med hänsyn till östruscykel skede av varje djur vid tidpunkten för ozonexponering. Vi också ta tillämplig bioinformatik förhållningssätt till miRNA upptäckten och målet identifieringsmetoder använder limma, en R/Bioconductor programvara, och funktionell analysprogramvara att förstå biologiska sammanhang och vägar i samband med differentiell miRNA uttryck.
mikroRNA (Mirna) är kort (19 till 25 nukleotider), naturligt förekommande, icke-kodande RNA-molekyler. Sekvenser av MicroRNA är evolutionärt bevarade mellan arter, tyder på vikten av MicroRNA reglera fysiologiska funktioner1. mikroRNA uttryck profilering har visat sig vara till hjälp för att identifiera MicroRNA som är viktiga i regleringen av olika processer, inklusive immunförsvaret, celldifferentiering, utvecklingsprocesser och apoptos2. Mer nyligen, MicroRNA erkänts för deras potentiella användning i sjukdom diagnostik och therapeutics. För forskare som studerar mekanismer för genreglering, kan mäta miRNA uttryck upplysa system-nivå modeller av tillsynsprocesser, särskilt när miRNA information kopplas till mRNA profilering och andra genomet-skala data3. Däremot, MicroRNA har också visat sig vara stabilare än mRNA i en rad olika provtyper och är också mätbara med större känslighet än proteiner4. Detta har lett till betydande intresse i utvecklingen av MicroRNA som biomarkörer för olika molekylär diagnostik program, inklusive lungsjukdomar.
I lungan spelar MicroRNA viktiga roller i utvecklingsprocesser och underhåll av homeostas. Dessutom har deras avvikande uttryck associerats med utveckling och progression av olika lungsjukdomar5. Inflammatorisk lungsjukdom som orsakas av luftföroreningar har visat större stränghet och sämre prognos hos kvinnor, vilket indikerar att hormoner och östruscykel kan reglera lung medfödd immunitet och miRNA uttryck i reaktioner på olika miljöutmaningar 6. i detta protokoll, vi använder ozonexponering, som är en viktig del av luftföroreningar, för att framkalla en form av lunginflammation hos honmöss som uppstår i avsaknad av adaptiv immunitet. Med hjälp av ozon, vi förmå utvecklingen av hyperreaktivitet i luftvägarna som är associerad med luftvägarna epitelial cellskador och en ökning av neutrofiler och inflammatoriska mediatorer i proximala airways7. För närvarande finns det inte väl beskrivna protokoll att karakterisera och analysera MicroRNA över östruscykel i ozon-exponerade möss.
Nedan beskriver vi en enkel metod för att identifiera östruscykel stadier och miRNA uttryck i lungvävnad av kvinnliga möss som utsätts för ozon. Vi också ta effektiv bioinformatik metoder miRNA upptäckten och target identifiering, med betoning på beräkningsbiologi. Vi analyserar microarray data med hjälp av limma, en R/Bioconductor-programvara som erbjuder en integrerad lösning för att analysera data från gen uttryck experiment8. Analys av PCR-array data från limma har en fördel när det gäller makt över t-test baserat tillvägagångssätt när du använder litet antal matriser/prover för att jämföra uttryck. För att förstå biologiska samband med miRNA uttryck resultat, använde vi sedan programvaran funktionell analys. För att förstå de mekanismer som reglerar transkriptionell förändringar och att förutsäga sannolika utfall, kombinerar programvaran miRNA-uttryck datamängder och kunskap från litteraturen9. Detta är en fördel jämfört med programvara som titta bara för statistiska berikning i överlappande uppsättningar av microRNA.
MikroRNA profilering är en fördelaktig teknik för både sjukdomsdiagnos och mekanistiska forskning. I detta manuskript definierat vi ett protokoll för att utvärdera uttrycket av MicroRNA som förutspås reglerar inflammatoriska gener i lungorna av kvinnliga möss som utsätts för ozon i olika östruscykel stadier. Metoder för bestämning av östruscykel, såsom visuell identifieringsmetoden, har varit beskrivs16. Dock dessa förlitar sig på enstaka mätningar och därför är opålitliga. …
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av bidrag från NIH K01HL133520 (PS) och K12HD055882 (PS). Författarna vill tacka Dr Joanna Floros för hjälpen med ozon exponering experiment.
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
-80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |