Studiet av amfibier biologi gir verdifull informasjon om reproduktive, fysiologiske, embryological og utviklingsmessige prosesser som driver organismer av mange taksonomisk grupper. Her presenterer vi en omfattende guide på ulike metoder som kan brukes til å studere eggstokkene kontroll og overvåking i amfibier.
Kontroll og overvåkning av eggstokkene i amfibier krever en mangesidig tilnærming. Det er flere programmer som kan lykkes indusere reproduktiv atferd og oppkjøp av kjønnscellene og embryo for fysiologisk eller molekylær forskning. Amfibier bidrar til en-12:45-tredjedel av virveldyr forskning, og av interesse i denne sammenhengen er deres bidrag til det vitenskapelige samfunnets kunnskap om reproduktive prosesser og embryological utvikling. Imidlertid er det meste av denne kunnskapen avledet fra et lite antall arter. I nyere tid har uttynning av amfibier over hele kloden krevde økende intervensjon av conservationists. Den fange utvinning og forsikring kolonier som fortsetter å dukke opp som svar på utryddelse risikoen gjøre eksisterende forskning og kliniske applikasjoner uvurderlig for overlevelse og reproduksjon av amfibier holdt under menneskelig omsorg. Suksessen til enhver fange befolkning er grunnlagt på sin helse og reproduksjon og evnen til å utvikle levedyktige avkom som viderefører den mest varierte genetiske representasjon av deres arter. For forskere og veterinærer, evnen til å overvåke og kontrollere eggstokkene utvikling og helse er derfor avgjørende. Fokuset i denne artikkelen er å fremheve de ulike assistert reproduktive teknikker som kan brukes til å overvåke og, der det er hensiktsmessig eller nødvendig, kontroll eggstokkene funksjon i amfibier. Ideelt sett bør eventuelle reproduktive og helsemessige problemer reduseres gjennom riktig fange husdyrhold, men som med alle dyr, spørsmål om helse og reproduktive patologi er uunngåelig. Ikke-invasive teknikker inkluderer atferdsdata vurderinger, visuell inspeksjon og palpasjon og morphometric målinger for beregning av kroppens tilstand indekser og ultralyd. Invasive teknikker inkluderer hormonelle injeksjoner, blod prøvetaking, og kirurgi. Eggstokkene kontroll kan utøves på en rekke måter, avhengig av søknaden som kreves og arter av interesse.
Amfibier har lenge vært anerkjent som viktige biologiske og medisinske modeller av et bredt spekter av forsknings disipliner. Data innhentet ved å studere spesielle arter som Xenopus laevis og X. tropicalis, Leopard frosken (Lithobates (tidligere Rana) Pipiens) og Axolotl (Ambystoma mexicanum) har blitt brukt til en rekke andre virveldyr, inkludert mennesker. Den veterinær, husdyrhold og assistert reproduktive teknikker som har kommet fra å studere disse og andre amfibier gi bistand til de som oppgave med å utvikle vellykket omsorg, vedlikehold og bærekraft av sjeldnere populasjoner i fangenskap 1 den andre , 2 andre priser , 3 andre priser , firetil.
Interessen er økende for samtidig bruk av in og ex situ bevaring-baserte tilnærminger til å reversere tidevannet av utryddelse for mange i fare amfibier arter1,2. Denne artikkelen gir metoder for øyeblikket tilgjengelig for å overvåke og kontrollere amfibier eggstokkene funksjon i modellen arter av anurans og Caudates. I tillegg er eksisterende teknikker for å løse en vanlig reproduktiv patologi av egg oppbevaring presenteres.
Som i mange taksonomisk grupper, amfibier eggstokkene kontroll innebærer en rekke tett synkroniserte interaksjoner mellom miljø og fysiologi. Temperatur og photoperiod (kjent som proximate signaler) dekodes av øyet og hjernen der de omdannes raskt til genetiske, hormonelle og døgn prosesser (ultimate signaler)3,4. Metodene for å overvåke og kontrollere eggstokkene funksjon som dekkes i denne artikkelen inkluderer invasive og ikke-invasiv teknikker. Institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) forskning og undervisning krav definere ikke-invasiv teknikker som de som vil føre til minimal til ingen fysisk smerte eller mental nød, og krever ingen smertestillende medikamenter5. Her, ikke-invasiv teknikker inkluderer visuell inspeksjon og palpasjon, atferdsmessige observasjoner, morphometric vurderinger og ultralyd. Tvert imot, teknikkene av blod samling, hormon administrasjon og kirurgi (ovarieektomi og fjerning av beholdt egg) er klassifisert som invasiv siden de kan føre til noen smerte eller ubehag og krever anestesi eller post-prosessuelle narkotika terapi.
Ikke-invasiv eggstokkene overvåking teknikker kan enkelt innlemmes i den daglige pleie rutine for de fleste fange amfibier. Avhengig av arten, eggstokkene svangerskap kan ofte bestemmes av enkel visuell inspeksjon (glass frosk). I andre tilfeller kan palpasjon indikere om en kvinne er gravid. Ulike kroppen tilstand indekser (BCI) som vekt, snute urostyle lengde (SUL), snute-vent lengde (SVL) og standard Mass Index (SMI) er tilgjengelig for å forutsi tilstedeværelse eller fravær av egg4,6,7, 8,9. Imidlertid bør forsiktighet tas med tolkningen av resultatene som de fleste ikke vurdere alder, kroppsfasong eller sammensetning (f. eks vann beholdt versus eggstokkene masse eller fett)6. Definitive reproduktive diagnoser kan oppnås via ultralyd med mer inngående kunnskap om egg utvikling og Oppsamling av cyster på fire eggstokkene syklus4,7. Ultralyd gir også et middel for å bekrefte og overvåke reproduktive patologi og tilhørende fysiologiske forhold4,8.
I tillegg til å gi informasjon om helsetilstand, kan blod prøvetaking brukes til å måle reproduktive hormoner. Hvis hormon profilering er det endelige målet, det er viktig å unngå stress-relaterte påvirkninger som kan forvirre systemisk steroid data. Stund en muligheter kraftfull avlytting verktøyet, det er ennå å bli en studere demonstrasjon medfødt endocrinological Svar å eksogene hormon administrasjon dersom noe amfibier art. Blod kan trygt tas fra flere steder; i frosker dette inkluderer ventrale abdominal vene, flerspråklig plexus, lår blodåre og hjerte9,10. I Caudates, blod er samlet fra ventrale halen vene. Graden av invasiveness, mengden av tilbakeholdenhet nødvendig, behovet for bedøvelse, delikatesse av orgelet blir målrettet, og størrelsen på dyret er faktorer som skal vurderes når du velger en samling teknikk for amfibier pasienten. Denne artikkelen vil presentere teknikken av blod samling fra ansikts maksillære eller musculocutaneous vene av frosker som opprinnelig beskrevet av Forzan et al.9.
Eggstokkene kontroll er arter-spesifikke og, som sådan, hormon protokoller bør testes og optimalisert. Annet enn sesongavhengige og tilhørende sirkulerende hormon miljøet, kan eggstokkene kontroll også være tett knyttet til alder, tidsbruk i fangenskap og eksponering for gjentatte Hormone administrasjon, som det er lite informasjon i litteraturen11 , 12 flere , 13. gjennomføringen av Hormone terapi for å lokke fram reproduktive atferd, Kjønnscelle produksjon, modning og oviposition har blitt en utbredt rapportert tilnærming til å løse vanlige reproduktive problemer forbundet med fangenskap4, 8,14,15,16. Fordi mekanismene kontrollerende reproduksjon i virveldyr er svært bevart, er det en rekke hormoner, nevropeptider og kommersielt tilgjengelige legemidler som brukes terapeutisk i andre taksonomisk grupper som også kan brukes pålitelig i en rekke amfibier arter (tabell 1). Gonadotropin-lanserer Hormone (GnRH) og humant gonadotropin (HCG) (eller variasjoner av disse, dvs, PMSG og EKG)17,18, enten individuelt eller i kombinasjon, har blitt brukt mye i amfibier fange avl programmer inkludert: den sørlige Rocky Mountain Boreal (Anaxyrus Boreas Boreas)4,19,20; soppen, Dusky Gopher frosk, Rana sevosa (Langhorne et al., upublisert)7; Gulf kysten Waterdog, Necturus beyeri20; Wyoming padde, Anaxyrus baxteri18; Bullfrog, Rana catesbiana21; den amerikanske padde, Anaxyrus americanus22; gresset frosk, Lymnodyaster tasmaniensis23; Coqui, Eleutherodactylus coqui24; Xenopus, Xenopus laevis25; Gunther ‘ s toadlet, Pseduophryne guentheri26; den nordlige Leopard frosken, Lithobates Pipiens; den argentinske horn-frosk, Ceratophrys utsmykkede; Cranwell ‘ s horn-frosk, C. cranwelli; den amerikanske Ground-Frog, Odontophrynus americanus27; og ilden Salamander (Salamandra)228. Steroid hormoner, som progesteron (P4), er mindre vanlig rapportert, men har vist god effekt i fremlokkende eggløsning og oviposition i enkelte arter av anurans16,18,29. Prostaglandiner (spesielt prostaglandin 2-Alpha (PGF2α)) er involvert i ovulation sammen med kortikosteroider30,31,32,34 og nå høye nivåer under ovulatory fase31.
I in vitro studier, er PGF2α en potent induser av ovulation31, mens in vivo det kan indusere oviposition av beholdt egg i Rana muscosa4,30,32. Hypofysen ekstrakter er også effektiv induktorer av eggløsning15,16,34; men bekymringer rundt biosikkerhet og potensialet for sykdoms overføring er ofte en avskrekkende for fanger avl kolonier når du vurderer denne tilnærmingen35.
Den siste delen av denne artikkelen detaljer kirurgiske prosedyrer og gir alternative tilnærminger for å utvide eggstokkene studier eller hjelp med oppløsningen av reproduktive patologi. Ovariectomies er vanligst utført i amfibier for å få oocytter for embryological forskning. Men det kan også gi et middel for beholdt egg når en annen alternativer mislykkes. Selv om denne prosedyren er invasiv, krever full anestesi og snitt for å avdekke egg massene, krever det ikke døds aktiv. Videre, etter delvis ovarieektomi, dyrene kanne lage en i sin helhet det å bli frisk og fortsette å bli reproductively aktiv stolpe-kirurgi8,36.
Protokollene beskrevet nedenfor skisserer invasiv og ikke-invasiv metoder for eggstokkene kontroll og overvåking i anurans og Caudates. Den spesifikke arten valgt å illustrere teknikker i anurans inkluderer R. mucosa og X. laevis. Necturus maculosus, n. beyeri, n. alabamensis, og A. mexicanum omfatter arten som brukes til å beskrive teknikker i Caudates på samme måte.
Direkte håndtering, visuell observasjon og morphometric tiltak gir ikke-invasiv teknikk og er de første vurderingskriteriene for fastsettelse av kvinnelig reproduktiv scene. Men, denne studien viser at gravid eggstokkene ikke kan alltid være pålitelig identifisert av palpasjon. Avhengig av arten, gravid eggstokkene kan noen ganger være visuelt oppdages gjennom semi-gjennomskinnelig (figur 13a, B) eller helt gjennomsiktig hud på ventrale siden av dyret (figur 13C). Kvinner som har fullført oviposition kan vise åpenbare endringer i sitt utseende i forhold til gravid kvinner (f. eks, løs hud og tap av opptil 30% av sin kroppsmasse, figur 13D). Under avl, menn og kvinner vil vise visse atferd som gir informasjon om nærhet til eggløsning og oviposition. Når det gjelder R. muscosa indikasjoner på at en kvinne er nær oviposition begynne med den kvinnelige inn handstands.
Anvendelsen av ultralydteknologi til anurans og Caudates tillater diagnostisering av tilstedeværelse eller fravær av egg og om oviposition var forbundet med fullstendig eller delvis frigjøring av utviklede egg. Dermed gir denne metoden en mer komplett og nøyaktig vurdering av reproduktive status uten å være begrenset til å bestemme gravid/ikke-gravid status via en visualisering teknikk som varierer etter abdominal huden åpenhet, eller epidermal konsistens blant forskjellige amfibier arter. Ultralyd kan utføres med relativ letthet og med lite stress til dyrene (figur 5 og figur 13) og kan brukes til å karakterisere reproduktive sykluser og å bestemme reproduktive status4. Det er avgjørende å bli kjent med arten; men denne studien viste at Necturus og R. muscosa dele felles utviklingsmessige tegn i sine reproduktive mønstre slik at tilsvarende klassifisering av reproduktive Stadium (figur 5). Gjennom denne teknologien er det nå bevis for at egg utvikling er høy i fange Necturus og R. muscosa og at begge disse artene følger et sesong mønster. Selv om årsakene til disse fenomener er ukjent og krever ytterligere undersøkelse, uten bruk av ultralyd, flere områder av eggstokkene dysfunksjon, slik som egg oppbevaring og delvis oviposition, ville ha gått uoppdaget. Fremtidige søknader til denne teknikken vil bli brukt til å avgjøre om kvinner bør velges for avl i et gitt år og om oviposition er fullført.
En blod samling protokoll, slik som det som presenteres i R. muscosa, som er både effektiv og forårsaker minimal nød til dyret, er optimal å studere hormon profiler i fangenskap og vill-fanget anurans (Calatayud, upublisert). Hittil finnes det ingen informasjon om den årlige hormonet profiler av fange R. muscosa og derfor ingen kunnskap om hvordan hormoner er å påvirke deres helse og reproduksjon. Videre, med bevis for at kvinner av denne arten ikke kan være årlige oppdrettere, hormonell profilering vil være en annen metode for sporing av eggstokkene sykluser. Sammen med ultralyd, hormon analyse kan føre til bedre prediksjon av hva kvinner vil være klar for oviposition. Videre, i det siste året, har to tilfeller av intersex i fange R. muscosa befolkningen er dokumentert. I tillegg har utviklingen av tommelen pads er notert på noen av de eldre grunnleggerne kvinner. Grunner for dette er for tiden under etterforskning, men første resultatene tyder på det kan forholde seg til endringer i testosteron nivåer (Calatayud, upublisert). Kresne hormonelle sykluser i kvinner i ulike aldre vil hjelpe oss å forstå hvorfor kvinner kan utvikle mannlig assosiert sekundære seksuelle egenskaper og om dette er å forvente i en aldrende befolkning.
Eksogene Hormone terapi har blitt brukt til å overvinne reproduktive dysfunksjoner ofte oppstått i fange amfibier. Imidlertid, for begge to R. muscosa og Necturus befolkninger i denne studere, nei vesentlige forskjellene inne oviposition imellom hormon-behandlet og administrere kvinner var oppdaget over en 2 og 5-år periode av tid, respectively. Dette kan tyde på at hormon administrasjon protokollen, doser, grunning og hormon kombinasjonen brukt var ikke tilstrekkelig for arten. Nærmere analyse av individuelle kvinnelige reproduktive historier antyder R. muscosa kan ikke oppleve årlig avl, som også kan gjøre rede for mangelen på hormonell effekt observert i behandlede kvinner. Fordi en viss prosentandel av kvinner konsekvent hoppet avl hvert år, forstå den naturlige historien av arten kan bidra til å avgjøre om det er behov for eksogene hormoner og når de kan være mest effektive. Prosedyrene som er beskrevet i denne artikkelen kan brukes på en rekke arter, (tabell 1) og er for anurans spenner fra 5 g til 150 g; større dyr kan kreve forskjellige sprøyter og nåle målere. Plasseringen av injeksjon varierer med noen hormoner som krever intra-muskuløse, intra-bukhulen, sub-hud eller intradermal injeksjon (figur 7).
Kirurgi i den hensikt å ovarieektomi er en vanlig metode som brukes i ulike amfibier arter å få oocytter for embryological studier. Ovarieektomi kan også være indisert for befolkningskontroll og medisinske spørsmål som egg oppbevaring. I tilfelle av delvis ovariectomies der, oocyte høsting er utført for forskningsformål, må kirurgi sørge for at dyret forblir reproduktive. Administrasjon av PGF2α har vist noen lover å løse egg oppbevaring i kvinnelige R. muscosa. I flere individer, PGF2α elicited fullstendig deponering av tidligere beholdt egg, men i andre bare delvis deponering skjedde krever manuell stripping å fjerne alle eggene. Mens PGF2α kan tjene som et alternativ til kirurgi for egg oppbevaring i R. muscosa, dens evne til å bøte på lignende patologisk forhold i andre amfibier vil kreve Art-spesifikk validering. Når kirurgisk inngrep er mandat for Anuran eller nucleus caudatus pasienten, er det nødvendig å sikre en tilstrekkelig fly av anestesi før snitt er gjort. Gløgg observasjon ferdigheter er nødvendig for å vurdere og overvåke de normative induksjon og utvinning svar som beskrevet i denne studien for hver av de dyr. Når man er kjent med den spesifikke anatomi, en hensiktsmessig kirurgisk tilnærming, hemostase, milde vev manipulasjon og tilstrekkelig postoperativ ledelse, reproduktive operasjoner utgjør ingen overveldende hindringer.
The authors have nothing to disclose.
Natalie Calatayud ønsker å takke Dr. Barbara Durrant for opplæring og assistanse med ultralyd og til Exploradora de Immuebles, S.A. (EISA) for tildeling av økonomisk støtte til min forsknings førsteamanuensis stilling ved SDZG. Takk til Dr. Kylie Cane for kommentarer på manuskriptet så vel som til den offisielle anmeldere (hvem de kan være). Takk til Jonathan Dain vår 2018 Summer Fellow, San Diego Zoo Institute for Conservation Research for å gi bilder (figur 1a, B). Monica Stoops strekker takknemlighet til Association of zoologiske hager og akvarier Conservation legat fondet og Disney Worldwide Conservation Fund for å gi økonomisk støtte til å etablere den fange Necturus befolkningen. I tillegg støtte ble også mottatt gjennom private donasjoner fra amfibier talsmann MS Iris de la Motte. Takk, er gitt til Mr. Christopher DeChant og Dr. Markus Campbell for deres betydelige bidrag til forskningen.
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems | GE medical systems | GE logiq Book XP | Ultrasound |
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex | GE medical systems | 8C-RS (10 MHz) | Ultrasound probe |
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) | Mettler Electronics Corp CA | Sonigel | Ultrasound gel (water soluble, salt-free) |
Hormone | |||
Gonadotropin releasing hormone | BACHEM | 4012028 | synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate abbreviation: GnRH |
Lutenizing hormone releasing hormone | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4033013; L1898 | synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt; [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate abbreviation: LHRH |
Human chorionic gonadotropin | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 | synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) abbreviation: hCG |
Prostaglandin 2α | Sigma-Aldrich | P40424; | synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris; abbreviation: PGF2α |
Follicle-stimulating hormone | Sigma-Aldrich | F4021, F8174 | synonym: porcine, sheep abbreviation: FSH |
Progesterone | Sigma-Aldrich | 46665; P7556 | synonym: Vetranal; P4 water soluble abbreviation: P4 |
Pituitary extract | na | synonym: Check papers for amphibian species derivation abbreviation: PE |
|
Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich | HOR-272; 493-10; 9002-70-4 | synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin abbreviation: PMSG |
Metaclopromide | Sigma-Aldrich | M0763 | synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide abbreviation: MET |
Lucrin | BACHEM; Sigma-Aldrich | 4033014; L0399 | synonym: Leuprorelin acetate abbreviation: Lucrin |
Lutalyse | Pfizer | synonym: PGF2α – Dinoprost tromethamine abbreviation: Lut |
|
Pimozide | Sigma-Aldrich | P1793 | synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one abbreviation: PZ |
Amphiplex | see above | synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide abbreviation: GnRH + MET |
|
Ovopel | Ovopel | na | synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) abbreviation: Ovo |
Ovaprim | Pentair aquatic eco-systems | Ova10 | synonym: Salmon gonadotropin + domperidone abbreviation: Ova |
Domperidone | Sigma-Aldrich | D122 | synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine abbreviation: DOM |