Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.
Abstract
Die zelluläre Prozesse werden durch transkriptionelle Modulation der spezifischen Genprogramme geregelt. Diese Modulation wird durch die kombinierte Aktionen einer breiten Palette von Transkriptionsfaktoren (TFs) und Cofaktoren Vermittlung transkriptionelle Aktivierung oder Unterdrückung über Veränderungen in der Chromatinstruktur erreicht. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine nützliche molekularbiologische Ansatz für mapping Histon Änderungen und Transkription Faktoren/Cofaktoren Bindung an DNA-profiling, wodurch eine Momentaufnahme der dynamischen nuklearen Veränderungen während der verschiedenen biologische Prozesse.
Um transcriptional Regelung im Fettgewebe zu studieren, abgeleitete von in-Vitro Zellkulturen von Proben verewigt oder Primärzelle Linien werden oft wegen der Fülle des Ausgangsmaterials in ChIP-Assays begünstigt und biologischen Variabilität reduziert. Jedoch stellen diese Modelle eine begrenzte Momentaufnahme des tatsächlichen Chromatin Staates in lebenden Organismen. So gibt es eine kritische Notwendigkeit für optimierte Protokolle, ChIP an Fettgewebe Proben abgeleitet aus Tiermodellen durchzuführen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente ChIP-Seq Histon-Modifikationen und Histonproteine im braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Das Protokoll ist für die Untersuchung von genomweiten Lokalisierung der Proteine des Interesses und epigenetischen Markern in der Fledermaus, die ein morphologisch und physiologisch unterschiedlichen Gewebe unter Fettdepots ist optimiert.
Introduction
Während weißen Fettgewebe (WAT) zur Speicherung von Energie spezialisiert ist, zerstreut braunes Fettgewebe (BAT) Energie in Form von Wärme aufgrund seiner Fähigkeit, Kohlenhydraten und Lipiden in Wärmeenergie über mitochondriale abkoppeln1umwandeln. Aufgrund dieser speziellen Funktion ist das Fledermaus-Depot für die Wartung der Körpertemperatur unter physiologischen Bedingungen und als Reaktion auf kalten Belichtung erforderlich. Während Veränderungen der Genexpression während BAT Differenzierung und nach thermogene Stress ausgiebig in vivo und in vitro untersucht wurden, die molekularen Mechanismen, die diese Änderungen meist seziert in immortalisierte Zelllinien und primäre gewesen Pre-Fettzellen, mit Ausnahme von mehreren Studien in vivo2,3,4,5.
Regulierung der spezifischen Ausdruck Genprogramme durch transcriptional Regelung wird erreicht durch koordinierte Änderungen im Chromatin Struktur über verschiedene Transkription Faktoren und Co Faktoren Aktionen. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist ein wertvolles Molekularbiologie-Ansatz für die Rekrutierung dieser Faktoren an der DNA zu untersuchen und für die Profilierung der damit einhergehenden Veränderungen in der Chromatin-Landschaft. Schlüsselfaktoren für den Erfolg des ChIP-Experimente gehören Optimierungen der Vernetzung und Chromatin Scheren Konsistenz in verschiedenen Proben, Verfügbarkeit von angemessenen Ausgangsmaterial und vor allem Qualität der Antikörper. Bei ChIP aus dem gesamten Gewebe, es ist auch wichtig zu prüfen, Heterogenität der Proben und das Protokoll zur Verbesserung der Effizienz der Kerne Isolation zu optimieren, wobei letztere ein besonders sensibler Schritt beim Arbeiten mit Fettgewebe aufgrund der erhöhte Fettgehalt. In der Tat, molekulare Isolierungstechniken aus ganzen adipösen Depots werden erschwert durch das Vorhandensein von hohe Konzentrationen von Triglyceriden und Protokolle müssen optimiert werden, um die Menge von Chromatin Isolierung erhöhen. Schließlich, wenn Hochdurchsatz-Sequenzierung nach ChIP-DNA-Isolierung durchgeführt wird, ist die Sequenzierung Tiefe entscheidend für die Bestimmung der Anzahl von Gipfeln, die sicher erkannt werden.
Hier verweisen wir auf die Arbeitsstandards und allgemeine Richtlinien zur ChIP-Seq-Experimente von ENCODE und ModENCODE Konsortien6 best Practices empfohlen, und wir konzentrieren uns auf eine schrittweise Beschreibung eines Protokolls für ChIP-Seq von BAT optimiert. Das beschriebene Protokoll ermöglicht effiziente Isolierung des Chromatins aus Fettgewebe genomweite Sequenzierung für DNA-bindenden Faktoren mit klar definierten Gipfeln sowie Histon-Marken mit diffuser Signale durchführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll stellt ein wertvolles Werkzeug für die Durchführung von ChIP aus murinen Geweben, speziell optimiert für braunen Fettgewebe. Eine der größeren Herausforderungen bei der Durchführung von ChIP von Gewebe ist eine ausreichende Anzahl von Zellen während der Probenvorbereitung erholen. Scheren die Fledermaus mit einem Gewebe Homogenisator Mixer gepaart mit Edelstahl Perlen statt einem kanonischen Glas Stößel deutlich reduziert die Anzahl der Zellen durch ununterbrochene Gewebe verloren…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- . Genome Browser Gateway Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- . Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: https://github.com/nboley/idr (2018)
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
