כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר
Summary
כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ’יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.
Abstract
תהליכים תאיים ביותר מוסדרים על ידי אפנון תעתיק של תוכניות גנים ספציפיים. אפנון כזה מושגת באמצעות הפעולות בשילוב של מגוון רחב של גורמי שעתוק (שר), cofactors בתיווכן של תעתיק או דיכוי באמצעות שינויים במבנה כרומטין. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) היא גישה ביולוגיה מולקולרית שימושי עבור מיפוי היסטון שינויים של פרופיל גורמי שעתוק/קשירה ל- DNA cofactors, ובכך לספק תמונת מצב של השינויים הדינמיים גרעיניים המתרחשים במהלך שונים תהליכים ביולוגיים.
ללמוד תקנה תעתיק של רקמת שומן, מונצחים דגימות נגזר במבחנה תרביות תאים של או קווים התא הראשי הם לעיתים קרובות העדיף בתוך השבב מבחני בגלל שפע מתחיל חומר מופחתת השתנות ביולוגי. עם זאת, מודלים אלה לייצג תמונה מוגבלת של המדינה בפועל כרומטין היצורים החיים. לפיכך, יש צורך קריטי עבור פרוטוקולים ממוטבת לבצע שבב על רקמת שומן דגימות שמקורם בבעלי חיים.
כאן נתאר פרוטוקול עבור שבב-seq יעיל של שינויים היסטון והן הלא-היסטון חלבונים בתוך רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. הפרוטוקול ממוטב חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים של עניין epigenetic סמני המחבט, אשר הוא רקמה מורפולוגית, מבחינה פיזיולוגית ברורים בין המחסנים שומן.
Introduction
בעוד שומן לבן (וואט) מתמחה לאחסון אנרגיה, רקמת שומן חום (בת) כלתה אנרגיה בצורת חום בשל יכולתה כדי להמיר אנרגיה תרמית ויה מיטוכונדריאלי uncoupling1פחמימות ושומנים. בגלל פונקציה מיוחדת זו, בתחנה בת נדרש עבור שמירה על טמפרטורת הגוף בתנאים פיזיולוגיים, בתגובה החשיפה הקרה. בזמן שינויים בביטוי גנים במהלך התמיינות בת ועל הלחץ תרמוגנית נחקרו בהרחבה ויוו, הפריה, המנגנונים המולקולריים שבבסיס שינויים אלה היו בעיקר גזור בקווים תא מונצחים ולא ראשי adipocytes מראש, למעט מספר מחקרים ויוו2,3,4,5.
התקנה של תוכניות ביטוי גנים ספציפיים באמצעות רגולציה תעתיק מושגת על ידי מתואמות לשינויים כרומטין מבנה דרך שעתוק שונים גורמים בשיתוף גורמים פעולות. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) היא גישה ביולוגיה מולקולרית יקר עבור חוקרים הגיוס של גורמים אלה ל- DNA, יצירת פרופיל השינויים הקשורים בנוף כרומטין. גורמי מפתח להצלחת הניסויים שבב כוללים אופטימיזציות של כרומטין ההטיה עקביות לאורך כל מדגמים שונים, זמינות של חומר המוצא נאותה ואיכות, בעיקר, של הנוגדנים ותנאים crosslinking. בעת ביצוע שבב של כל הרקמות, חשוב גם לשקול הטרוגניות של הדגימות ולמטב את פרוטוקול כדי לשפר את היעילות של גרעינים בידוד, עם האחרון להיות צעד רגישים במיוחד בעת עבודה עם רקמת שומן בשל התוכן שומנים בדם גבוהות. למעשה, טכניקות הבידוד המולקולרי של אדיפוז בכל מחסני הם מסובכים על ידי הנוכחות של רמות גבוהות של טריגליצרידים, פרוטוקולים חייב להיות ממוטב כדי להגדיל את כמות בידוד כרומטין. לבסוף, כאשר רצף תפוקה גבוהה מבוצע לאחר בידוד שבב-DNA, העומק רצף הוא קריטי לקביעת מספר פסגות שזוהו בביטחון.
כאן, אנו מתייחסים תקני עבודה והנחיות כלליות לניסויים שבב-seq המומלץ על ידי קידוד ו- modENCODE קונסורציומים6 מומלצות של, אנו מתמקדים תיאור צעד אחר צעד של פרוטוקול אופטימיזציה עבור שבב-seq (BAT). הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד יעיל של כרומטין של רקמת שומן לביצוע ברמת הגנום רצפי DNA מחייב גורמים עם פסגות מוגדרים היטב, כמו גם סימני היסטון עם אותות מתמשכת.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מייצג כלי רב ערך עבור ביצוע שבב של רקמות מאתר, הממוטב במיוחד רקמת שומן חום. אחד האתגרים גדול בביצוע שבב מרקמות מתאוששת מספר מספיק של תאים במהלך הכנת הדוגמא. הטיית את המחבט באמצעות בלנדר מהמגן רקמות בשילוב עם חרוזים פלדת אל-חלד במקום כבעלי זכוכית הקנוני משמעותית מפחית א…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- . Genome Browser Gateway Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- . Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: https://github.com/nboley/idr (2018)
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
