Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation
Summary
여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.
Abstract
대부분 세포 프로세스는 특정 유전자 프로그램의 transcriptional 변조에 의해 통제 된다. 이러한 변조 다양 한 녹음 방송 요인 (TFs) 및 공동 인자 중재 transcriptional 활성화 또는 염색 질 구조에 변화를 통해 억압의 결합 된 행동을 통해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 히스톤 수정 매핑 및 다른 하는 동안 발생 하는 동적 핵 변화의 스냅숏으로 제공 녹음 방송 요인/공동 인자 dna 바인딩 프로 파일링을 위한 유용한 분자 생물학 접근 생물 학적 프로세스입니다.
공부 하 고 지방 조직에 transcriptional 규칙, 체 외에서 세포 배양의에서 파생 된 샘플 불후 또는 1 차 셀 라인 시작 물자의 풍부 때문에 칩 분석 실험에 종종 선호 하 고 생물 다양성을 감소. 그러나, 이러한 모델 생명체에서 실제 chromatin 상태의 제한 된 스냅숏을 나타냅니다. 따라서, 동물 모델에서 파생 된 지방 조직 샘플에 칩을 수행 하기 위해 최적화 된 프로토콜에 대 한 중요 한 필요는.
여기 우리는 히스톤 수정 및 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 고립에 있는 비 히스톤 단백질의 효율적인 칩 seq에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 관심과 지방 저장소 사이 형태학 상으로 그리고 생리 적으로 뚜렷한 조직 박쥐에 epigenetic 마커 단백질의 게놈 넓은 지역화를 조사 하 고 최적화 되어 있습니다.
Introduction
반면 흰색 adipose 조직 (WAT)는 에너지 저장을 위해 전문화 된다, 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐) 열 에너지를 통해 미토 콘 드리 아 연결을 푸는1탄수화물과 지질을 변환 하는 기능으로 인해 열 형태로 에너지 없어져 요. 이 특수 기능 때문에 박쥐 디포는 생리 적 조건에 찬 노출에 대 한 응답에 체온의 유지 보수를 위해 필요 합니다. 진 식 변화와 박쥐 차별화 동안 thermogenic 스트레스에 따라 vivo에서 그리고 생체 외에서 광범위 하 게 공부 되었다, 그러나 분자 메커니즘 기본이 변경 되었습니다 주로 불멸 하 게 세포에 해 부와 기본 vivo에서 몇몇 예외 사전 adipocytes,2,3,,45를 공부 한다.
Transcriptional 규칙을 통해 특정 유전자 식 프로그램의 조정된 변화 chromatin 구조를 통해 다양 한 녹음 방송 요인 및 공동 작업 요인에 의해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 DNA 이러한 요소의 채용 조사 및 프로 파일링 chromatin 풍경에 관련 된 변화에 대 한 귀중 한 분자 생물학 접근 이다. 칩 실험의 성공에 대 한 핵심 요인 가교 조건 및 적절 한 시작 물자 및, 특히, 항 체의 품질의 다른 예제를 통해 chromatin 전단 일관성의 최적화를 포함합니다. 전체 조직에서 칩을 수행할 때 그것은 또한 중요 한 고려 하는 샘플의이 고 핵 격리의 효율성을 개선 하기 위해 프로토콜 최적화, 후자와 되 고 특히 민감한 단계 때문에 지방 조직에서 작업할 때 상승 된 지질 내용입니다. 사실, 전체 지방 창 고에서 분자 격리 기술을 높은 수준의 트리 글리세라이드의 존재에 의해 복잡은 고 chromatin 격리의 양을 증가 시키는 프로토콜을 최적화 해야 합니다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱 칩-DNA 분리 후 수행 될 때 시퀀싱 깊이 봉우리는 자신 있게 검색의 수를 결정 하기 위한 중요 합니다.
여기, 우리 작업 표준 및 인코딩 및 modENCODE 컨소시엄6 모범 사례에 대 한 권장 하는 칩 seq 실험에 대 한 일반적인 지침을 참조 하 고 우리는 칩 seq 박쥐에서 최적화 된 프로토콜에 대 한 단계별 설명에 초점. 설명된 프로토콜 chromatin 지방 조직에서의 효율적인 절연에 대 한 더 확산 신호와 히스톤 부호 뿐만 아니라 잘 정의 된 봉우리 DNA 바인딩 요소에 대 한 게놈 넓은 시퀀싱을 수행 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 murine 조직, 갈색 지방 조직 최적화에서 칩을 수행 하기 위한 유용한 도구를 나타냅니다. 조직에서 수행 하는 칩에 큰 과제 중 하나는 샘플 준비 하는 동안 세포의 충분 한 수를 회복 됩니다. 박쥐는 정식 유리 유 봉 대신 스테인리스 구슬 크게 결합 조직 균질 화기 믹서 기를 사용 하 여 전단 파손 되지 않는 조직으로 인해 손실 된 세포의 수를 줄입니다. 또한, 소형 버퍼에?…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
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