Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.
Abstract
Processos mais celulares são regulados pela modulação transcriptional de programas específicos de gene. Tal modulação é conseguida através das ações combinadas de uma ampla gama de fatores de transcrição (TFs) e cofactores mediando ativação transcricional ou repressão através de alterações na estrutura da cromatina. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma abordagem útil biologia molecular para mapeamento de modificações do histone e criação de perfil de fatores de transcrição/cofactores ligação ao DNA, assim fornecendo um instantâneo das dinâmicas mudanças nucleares ocorridos durante as diferentes processos biológicos.
Para estudar o Regulamento transcriptional no tecido adiposo, amostras provenientes em vitro culturas de células de imortalizado ou linhas de célula primária muitas vezes são favorecidas em ensaios de ChIP por causa da abundância de material começar e reduziram variabilidade biológica. No entanto, estes modelos representam um instantâneo limitado do estado real da cromatina em organismos vivos. Assim, há uma necessidade crítica para protocolos otimizados executar o ChIP em amostras de tecido adiposo derivadas de modelos animais.
Aqui descrevemos um protocolo para eficiente ChIP-seq de modificações do histone e proteínas não-histonas no tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. O protocolo é otimizado para investigar todo o genoma de localização das proteínas de interesse e epigenéticas marcadores no morcego, que é um tecido morfologicamente e fisiologicamente distinto entre os depósitos de gordura.
Introduction
Enquanto o tecido adiposo branco (WAT) é especializado para o armazenamento de energia, o tecido adiposo marrom (BAT) dissipa energia na forma de calor devido a sua habilidade para converter carboidratos e lipídios em energia térmica através de desacoplamento mitocondrial1. Por causa desta função especializada, é necessário para a manutenção da temperatura do corpo em condições fisiológicas e em resposta à exposição fria o depósito de morcego. Enquanto mudanças de expressão do gene durante a diferenciação de morcego e após estresse termogênico têm sido muito estudadas in vivo e in vitro, os mecanismos moleculares subjacentes a essas mudanças têm sido principalmente dissecado em linhas celulares imortalizado e primário pré-adipócitos, com excepção dos vários estudos in vivo2,3,4,5.
Regulamento dos programas de expressão do gene específico através de uma regulação transcricional é conseguido coordenadas mudanças na cromatina estrutura através de transcrição de vários fatores e fatores co ações. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma abordagem valiosa de biologia molecular para investigar o recrutamento desses fatores ao DNA e perfilando as associado mudanças na paisagem da cromatina. Fatores-chave para o sucesso das experiências de ChIP incluem otimizações de reticulação condições e cromatina corte consistência ao longo de diferentes amostras, disponibilidade de matérias-primas adequadas e, principalmente, a qualidade dos anticorpos. Ao executar o ChIP de tecidos, também é importante considerar a heterogeneidade das amostras e otimizar o protocolo para melhorar a eficiência do isolamento de núcleos, com o último sendo um passo particularmente sensível ao trabalhar com tecido adiposo devido a o conteúdo lipídico elevado. Na verdade, técnicas de isolamento molecular de depósitos de todo tecido adiposos são complicadas pela presença de altos níveis de triglicérides, e protocolos devem ser otimizados para aumentar a quantidade de isolamento de cromatina. Finalmente, quando arranjar em sequência do elevado-throughput é realizado após o isolamento do DNA-ChIP, a profundidade de sequenciamento é fundamental para determinar o número de picos que são detectados com confiança.
Aqui, nos referimos às normas de trabalho e orientações gerais para experimentos de ChIP-seq recomendados pelo ENCODE e modENCODE consórcios6 para as melhores práticas, e focamos em uma descrição passo a passo de um protocolo otimizado para ChIP-seq de BAT. O protocolo descrito permite isolamento eficiente da cromatina do tecido adiposo para realizar o sequenciamento de genoma-largo para fatores de ligação a DNA com picos bem definidos, bem como marcas de histona com sinais mais difusos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui representa uma ferramenta valiosa para a realização de ChIP de tecidos murino, especificamente otimizados para marrom de tecido adiposo. Um dos maiores desafios na execução de ChIP de tecido está se recuperando de um número suficiente de células durante a preparação da amostra. Corte o taco usando um liquidificador de homogeneizador de tecidos juntamente com esferas de aço inoxidável em vez de um pilão de vidro canônico significativamente reduz o número de células que perderam dev…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
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