تصور لهيكل ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام تلطيخ كل جبل
Summary
تركيز هذه الدراسة لإثبات هذه التقنية إيمونوستينينج والتصور الجامع-جبل كطريقة مثالية لتصوير ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البنية والخلوية المكون.
Abstract
الأنسجة الدهنية جهازا هاما ايضية مع اللدونة العالية والاستجابة للمحفزات البيئية والحالة الغذائية. على هذا النحو، تم وضع تقنيات مختلفة لدراسة مورفولوجية وبيولوجيا الأنسجة الدهنية. مع ذلك، تقتصر أساليب التصور التقليدي لدراسة الأنسجة في 2D المقاطع، الفشل في القبض على بنية ثلاثية الأبعاد للجهاز كله. نقدم هنا كل جبل تلطيخ، أسلوب إيمونوهيستوتشيميستري الذي يحافظ على مورفولوجيا الأنسجة الدهنية سليمة مع خطوات الحد الأدنى من المعالجة. ومن ثم، يتم الاحتفاظ بهياكل adipocytes والمكونات الخلوية الأخرى دون تشويه، تحقيق التصور 3D الأكثر تمثيلاً من الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين الجامع-جبل تلطيخ مع النسب تتبع أساليب لتحديد الخلية مصير القرارات. ومع ذلك، هذه التقنية على بعض القيود لتوفير معلومات دقيقة فيما يتعلق بأجزاء أعمق من الأنسجة الدهنية. للتغلب على هذا التحديد، تلطيخ كل جبل يمكن أن تكون كذلك جنبا إلى جنب مع الأنسجة تبادل تقنيات إزالة التكتم الأنسجة والسماح للتصور الكامل لتشريح الأنسجة الدهنية كاملة باستخدام ورقة الضوء الفلورسنت الفحص المجهري. ولذلك، يمكن التقاط دقة أعلى وتمثيل أكثر دقة لهياكل الأنسجة الدهنية مع المزيج من هذه الأساليب.
Introduction
الأنسجة الدهنية جهازا أساسيا لتخزين الطاقة وتتميز بتجديد حيوية والتوسع غير محدود تقريبا1. بالإضافة إلى التوازن الطاقة، الأنسجة الدهنية أيضا دوراً أساسيا في إفراز هرمون أديبوكينيس ما يزيد على 50 تعدل وظيفة التمثيل الغذائي في الجسم كله2. وقد الأنسجة الدهنية الهندسة المعمارية المتنوعة وتضم مختلف أنواع الخلايا بما في ذلك adipocytes ناضجة والليفية، وخلايا بطانية، الخلايا المناعية و الخلايا السلف adipocyte3. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن السمنة وغيرها الخلل الأيضي يمكن أن يغير كثيرا من وظيفة الأنسجة الدهنية ولها المكروية، التي تشمل ولكن لا تقتصر على توسيع adipocytes، تسلل الخلايا التحريضية (مثلاً، الضامة)، و3من خلل الأوعية الدموية.
التقنيات المورفولوجية التقليدية مثل الأنسجة وكريوسيكتيونينج تثبت العديد من القيود في دراسة البيولوجيا الدهنية مثل خطوات المعالجة الكيميائية الطويلة، التي يمكن أن تؤدي إلى الأنسجة انكماش وهيكل التشويه3، 4. وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات 2D غير كافية لمراقبة التفاعلات بين الخلايا التي تمارسها أنواع الخلايا المختلفة، حيث أن المقاطع التي تم الحصول عليها محدودة إلى مناطق أصغر من الأنسجة كامل3. أساليب التصوير الفلورسنت مقارنة بالتقليدية، يلطخ كل جبل لا يتطلب خطوات إضافية الغازية، مثل التضمين وتمزيقها والجفاف؛ وهكذا، حتى تتجنب مشكلة تناقص خصوصية جسم. على هذا النحو، وطريقة بسيطة وفعالة لتصوير الأنسجة الدهنية، مع الحفاظ على أفضل مورفولوجيا adipocyte و هيكل الأنسجة الدهنية عموما5. ولذلك، كل جبل تلطيخ كما أنشئت تقنية إيمونولابيلينج سريعة وغير مكلفة للمحافظة على الأنسجة الدهنية البنية ثلاثية الأبعاد1،6،،من78.
ومع ذلك، على الرغم من المحافظة على مورفولوجيا الأنسجة الدهنية مع استخدام تلوين كل جبل، هذا الأسلوب لا يزال غير قادر على تصور الهياكل الداخلية تحت سطح الأنسجة الدهنية. وقد أنشأت مؤخرا عدة دراسات9،10 الأنسجة تبادل التقنيات جنبا إلى جنب مع الجامعة-جبل إيمونولابيلينج1،6 للسماح للتصور 3D شاملة داخل الأنسجة الدهنية. على وجه الخصوص، كانت تصور الشبكات العصبية والمفرج كثيفة في الأخيرة دراسات9،10،،من1112 مع تصوير حجم ثلاثي الأبعاد. في الواقع، دراسة اللدونة العصبية والأوعية الدموية للأنسجة الدهنية تحت ظروف فسيولوجية مختلفة ضروري لدراسة عن علم الأحياء. تمكين إيمونولابيلينج تصوير ثلاثي الأبعاد لإزالة الأنسجة أجهزة مسح مذيب (إيديسكو +) عملية تتألف من الميثانول المعالجة المسبقة، إيمونولابيلينج، وإزالة الأنسجة التكتم مع الكواشف الكيميائية العضوية الميثان (DCM ) وخماسي البروم ثنائي الفينيل (قسم تعزيز الحدود) ديبينزيل13،14. بجعل الأنسجة الدهنية شفافة تماما، تمثيل أكثر دقة للتشريح داخل الأنسجة مثل الأوعية الدموية والألياف العصبية ويمكن الحصول على9،10. إيديسكو + مزايا في هذا ومتوافق مع مختلف الأجسام المضادة والصحفيين الفلورسنت11،14، وقد أثبت نجاحا في العديد من الأجهزة وامبريوس حتى14. غير أن القيد الرئيسي وقت حضانة طويلة، التي تحتاج إلى 18 إلى 20 يوما لإكمال هذه التجربة كاملة.
تطبيق هام آخر لتلطيخ كل جبل هو تصور مصير الخلية في تركيبة مع نظام تتبع نسب. تتبع النسب هو وسم الجينات/علامة معينة في خلية التي يمكن أن تنتقل إلى كافة الخلايا الوليدة، وهو يحافظ على مر الوقت15. على هذا النحو، هو أداة قوية يمكن استخدامها لتحديد مصير أي خلية ذرية15. منذ التسعينات، أصبح النظام المؤتلف Cre-لوكسب نهج قوية لتتبع النسب في معيشة الكائنات الحية15. عندما يتم عبرت خط ماوس تعرب لجنة المساواة العرقية، إنزيم الحمض النووي recombinase، مع آخر سطر الماوس معربا عن مراسل المجاورة لتسلسل لوكسب-توقف-لوكسب، هو بروتين مراسل أعرب15.
لتلوين كل جبل، استخدام الصحفيين متعدد الألوان الفلورية مناسبة للتصوير من الأنسجة الدهنية لأنه يسمح لتدخل الحد الأدنى مع الأنشطة داخل الخلايا من adipocyte16. إلا أن الصحفيين التقليدية عادة وصمة عار السيتوبلازم، مما يجعل من الصعب تتبع نسب adipocytes بيضاء، التي حدت من هيولى المحتوى17. للتغلب على هذه المشكلة، استخدام الغشاء زمنياً الفلورسنت تدتوماتو/غشاء اجفب (mT/mG) مراسل ماركر أداة مثالية. يتم التعبير عن تدتوماتو المستهدفة للغشاء في الخلايا Cre سالب18. عند ختان لجنة المساواة العرقية، ويحدث التحول إلى التعبير عن اجفب المستهدفة للغشاء، مما يجعل هذا المراسل مناسبة لتتبع نسب adipocyte المتكفل17،18 (تكميلية الشكل رقم 1).
والغرض من هذه الورقة هو تقديم بروتوكول مفصل لتلطيخ كل جبل، وإظهار كيف أنه يمكن دمجها مع تقنيات أخرى لدراسة التنمية وعلم وظائف الأعضاء من الأنسجة الدهنية. أمثلة اثنين من الطلبات المبينة في هذا البروتوكول يتم استخدامه مع خطوط الماوس مراسل 1) متعدد الألوان لتحديد أصول مختلفة adipocytes و 2) الأنسجة المقاصة لمزيد تصور أربوريزيشن العصبية في الأنسجة الدهنية البيضاء (وات).
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن تعود بفوائد التقنيات التقليدية مثل الأنسجة وكريوسيكتيون لمراقبة الهيكل داخل الخلايا، يلطخ كل-جبل يقدم وجهة نظر مختلفة في الأنسجة الدهنية للبحوث، التي تمكن 3D التصور الخلوي هندسة الأنسجة المجهزة الحد الأدنى.
من أجل نجاح أداء الجامعة-جبل تلطيخ، الاقتراحات ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة) من كندا، والطيار ومنحة دراسة الجدوى من بانتنغ وأفضل السكري المركز (بدك)، “الصندوق بدء سيككيدس” إلى ح-ك. س.، “برنامج مركز البحوث الطبية” (2015R1A5A2009124) عبر الوطنية البحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، وتخطيط المستقبل إلى ي-ر. ك.
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
