Visualisering af 3D hvidt fedtvæv struktur ved hjælp af hele-mount farvning
Summary
Fokus for den foreliggende undersøgelse er at demonstrere hele-mount immunfarvning og visualisering teknik som en ideel metode til 3D imaging af fedtvæv arkitektur og trådløse komponent.
Abstract
Fedtvæv er en vigtig metaboliske organ med høj plasticitet og er lydhør over for miljø stimuli og næringsstof status. Som sådan, er forskellige teknikker blevet udviklet for at studere morfologi og biologi af fedtvæv. Konventionelle visualisering metoder er dog begrænset til at studere væv i 2D sektioner, ikke at fange den 3D arkitektur af hele orglet. Her præsenterer vi hele-mount farvning, en Immunhistokemi metode, der bevarer intakt fedtvæv morfologi med minimal behandlingstrin. Derfor vedligeholdes strukturerne af adipocytter og andre cellulære komponenter uden forvrængning, at opnå den mest repræsentative 3D visualisering af væv. Derudover kan hele-mount farvning kombineres med afstamning sporingsmetoder til at bestemme celle skæbne beslutninger. Denne teknik har dog nogle begrænsninger at give nøjagtige oplysninger om dybere dele af fedtvæv. For at overvinde denne begrænsning, kan hele-mount farvning yderligere kombineres med væv clearing-teknikker til at fjerne uigennemsigtighed af væv og giver mulighed for komplet visualisering af hele fedtvæv anatomi ved hjælp af lys-ark fluorescerende mikroskopi. Derfor kan en højere opløsning og mere nøjagtig repræsentation af fedtvæv strukturer blive fanget med kombinationen af disse teknikker.
Introduction
Fedtvæv er et vigtigt organ for energilagring og er præget af dynamisk ombygning og næsten ubegrænset udvidelse1. Ud over energi homøostase spiller fedtvæv også en væsentlig rolle i hormon sekretion af over 50 adipokines at modulere hele kroppen metabolisk funktion2. Fedtvæv har en varieret arkitektur bestående af forskellige celletyper, herunder modne adipocytter, fibroblaster, endotelceller, immunceller og adipocyt stamfader celler3. Nylige undersøgelser har vist, at fedme og andre metabolisk dysfunktion kan i væsentlig grad ændre fedtvæv funktion og dens mikromiljø, som omfatter, men er ikke begrænset til udvidelsen af adipocytter, infiltration af inflammatoriske celler (f.eks. makrofager), og vaskulær dysfunktion3.
Konventionelle morfologiske teknikker såsom histologi og cryosectioning vise flere begrænsninger i studerer adipøst biologi som langvarige kemiske behandlingstrin, som kan føre til væv svind og struktur forvrængning3, 4. Disse 2D teknikker er desuden utilstrækkelige til at observere intercellulære interaktioner udøves af forskellige celletyper, som afsnittene opnået er begrænset til mindre regioner i hele væv3. Sammenlignet med konventionelle metoder til fluorescerende imaging, hele-mount farvning ikke kræver yderligere invasive skridt, såsom indlejring, skæring og dehydrering; således undgår dette problem af faldende antistof specificitet. Som sådan, er det en enkel og effektiv metode for billedbehandling fedtvæv, med bedre bevarelse af adipocyt morfologi og samlede fedtvæv struktur5. Derfor hele-mount farvning som en hurtig og billig immunolabeling teknik blev oprettet for at bevare fedtvæv 3D arkitektur1,6,7,8.
Men trods bevarelse af fedtvæv morfologi med brug af hele-mount farvning, denne teknik er stadig ude af stand til at visualisere indre strukturer under lipid overfladen af væv. Flere nyere undersøgelser9,10 har etableret væv clearing teknikker kombineres med hele-mount immunolabeling1,6 at give mulighed for omfattende 3D visualisering i fedtvæv. Især blev tætte neurale og Vaskulaturen netværk visualiseret i de seneste undersøgelser9,10,11,12 med 3D volumen billeddannelse. Faktisk, at studere de neurale og vaskulære plasticitet af fedtvæv under forskellige fysiologiske tilstande er vigtigt at studere dets biologi. Immunolabeling-aktiveret tredimensional billeddannelse af opløsningsmiddel-ryddet organer (iDISCO +) væv clearing er en proces bestående af methanol forbehandling, immunolabeling, og clearing af væv uigennemsigtighed med organiske kemiske reagenser dichlormethan (DCM ) og dibenzyl ether (DBE)13,14. Ved at gøre fedtvæv helt gennemsigtig, kan en mere nøjagtig repræsentation af anatomi inden for væv såsom blodkar og neurale fibre fremstillet9,10. IDISCO + har fordele, idet den er kompatibel med forskellige antistoffer og fluorescerende reportere11,14, og det er påvist succes i flere organer og endda embryoner14. Dens vigtigste begrænsning er imidlertid en lang inkubationstiden, hvor 18-20 dage er nødvendig for at fuldføre hele eksperimentet.
En anden vigtig anvendelse af hele-mount farvning er visualisering af celle skæbne i kombination med en afstamning sporingssystem. Afstamning sporingen er mærkning af et bestemt gen/mærke i en celle, der kan overføres til alle datterceller og bevares over tid15. Som sådan, er det et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at bestemme skæbnen for en celle afkom15. Siden 1990 ‘ erne, Cre-LoxP rekombinant systemet er blevet en kraftfuld tilgang til afstamning sporingen i levende organismer15. Når en mus linje, der udtrykker Cre, et DNA recombinase enzym, krydses med en anden mus linje at udtrykke en reporter, der støder op til en loxP-STOP-loxP sekvens, er reporter protein udtrykt15.
For hele-mount farvning, er brug af fluorescerende multicolor journalister velegnet til billeddannelse af fedtvæv, fordi det giver mulighed for minimal interferens med intracellulære aktiviteter adipocyt16. Dog pletten traditionelle reportere typisk cytoplasma, hvilket gør det vanskeligt at spore slægt hvide adipocytter, hvilket har begrænset cytoplasmatisk indhold17. For at løse dette problem, er brug af membran-bundet fluorescerende tdTomato/membran eGFP (mT/mG) reporter markør et ideelt værktøj. Membran-målrettet tdTomato udtrykkes i Cre-negative celler18. Ved Cre excision opstår en switch til ekspression af membran-målrettet eGFP, hvilket gør denne reporter velegnet til sporing lineage adipocyt stamfaderen17,18 (Tillægs figur 1).
Formålet med dette dokument er at give en detaljeret protokol for hele-mount farvning og vise, hvordan det kan kombineres med andre teknikker til at studere den udvikling og fysiologi af fedtvæv. To eksempler på programmer, der er beskrevet i denne protokol er dets anvendelse med 1) flerfarvet reporter mus linjer til at identificere forskellige oprindelser adipocytter og 2) væv clearing for at yderligere visualisere det neurale arborization i hvidt fedtvæv (WAT).
Protocol
Representative Results
Discussion
Selvom konventionelle teknikker såsom histologi og cryosection giver fordele for observere intracellulære struktur, giver hele-mount farvning et andet perspektiv i fedtvæv forskning, som gør det muligt for 3D visualisering af cellulære arkitektur af minimalt forarbejdede væv.
For at fuldføre hele-mount farvning, bør følgende forslag tages i betragtning. Forskellige fedtvæv depoter kan give forskellige immunfarvning resultater; således, typen af fedtvæv depot anvendes bør fastlægg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra naturvidenskab og teknisk forskning Rådet (NSERC) af Canada, Pilot og Feasibility Study Grant Banting & bedste Diabetes Center (BBDC), SickKids Start-up fonden til H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT og fremtiden planlægger at Jørgensen-Lisbeth
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
