Visualisation de la Structure du tissu adipeux blanc 3D utilisant entier-Montez la souillure
Summary
L’objectif de la présente étude est de montrer la technique d’immunohistochimie et visualisation entier-montent comme une méthode idéale pour l’imagerie 3D du composant d’architecture et cellulaires du tissu adipeux.
Abstract
Le tissu adipeux est un organe métabolique avec grande plasticité et est sensible aux stimuli de l’environnement et l’état nutritionnel. Par conséquent, différentes techniques ont été développées pour étudier la morphologie et la biologie du tissu adipeux. Cependant, les méthodes de visualisation conventionnels sont limitées à l’étude du tissu dans des sections 2D, de la capture de l’architecture 3D de la totalité de l’organe. Nous présentons ensemble monture coloration, une méthode immunohistochimique qui conserve intact le tissu adipeux morphologie avec des étapes de traitement minimal. Par conséquent, les structures des adipocytes et autres constituants cellulaires sont maintenues sans distorsion, atteindre la visualisation 3D plus représentative du tissu. En outre, entier-Montez la souillure est cumulable avec les méthodes de traçage de lignée afin de déterminer les décisions de destin cellulaire. Cependant, cette technique a quelques limitations à fournir des renseignements exacts au sujet des parties plus profondes du tissu adipeux. Pour contourner cette limitation, entier-Montez la souillure peut être combinée avec des tissus techniques pour supprimer l’opacité des tissus et permettre une visualisation complète d’anatomie de tout le tissu adipeux en microscopie fluorescente lumière-feuille de compensation. Par conséquent, une résolution plus élevée et la plus fidèle des structures de tissu adipeux peuvent être capturés avec la combinaison de ces techniques.
Introduction
Le tissu adipeux est un organe essentiel pour le stockage de l’énergie et se caractérise par la dynamique de rénovation et expansion presque illimitée1. En plus de l’homéostasie énergétique, tissu adipeux joue également un rôle essentiel dans la sécrétion de l’hormone de plus de 50 adipokines pour moduler la fonction métabolique corps entier2. Le tissu adipeux a une architecture diversifiée composée de divers types de cellules, y compris les adipocytes matures, fibroblastes, cellules endothéliales, les cellules immunitaires et de cellules progéniteurs adipocytaires3. Des études récentes ont montré que l’obésité et autres dysfonctions métaboliques peuvent modifier considérablement fonction du tissu adipeux et son microenvironnement, qui inclut, mais n’est pas limité à l’élargissement des adipocytes, infiltration de cellules inflammatoires (par exemple, macrophages) et la dysfonction vasculaire3.
Techniques morphologiques classiques comme l’histologie et cryosectioning démontrent plusieurs limitations dans l’étude de la biologie adipeuse comme étapes longues de traitement chimique, qui peut conduire au tissu structure et rétrécissement distorsion3, 4. En outre, ces techniques 2D ne suffisent pas à observer les interactions intercellulaires exercées par différents types de cellules, comme les sections obtenues sont limitées à des régions plus petites du tissu entier3. Par rapport aux classiques des méthodes d’imagerie fluorescente, entier-Montez la souillure n’exige pas des étapes supplémentaires d’envahissantes, telles que l’incorporation, le sectionnement et la déshydratation ; ainsi, cela évite le problème de diminuer la spécificité de l’anticorps. Par conséquent, c’est une méthode simple et efficace pour l’imagerie du tissu adipeux, avec une meilleure conservation de la morphologie de l’adipocyte et globale du tissu adipeux structure5. Par conséquent, entier-Montez souillure comme une technique rapide et peu coûteux immunomarquage a été créée pour préserver le tissu adipeux architecture 3D1,6,7,8.
Cependant, malgré la conservation de la morphologie du tissu adipeux avec utilisation d’entier-Montez la souillure, cette technique est toujours pas en mesure de visualiser les structures intérieures sous la surface des lipides du tissu. Plusieurs récentes études9,10 ont mis en place les tissus techniques combinées avec ensemble monture immunomarquage1,6 , permettant la visualisation 3D complète dans le tissu adipeux de compensation. En particulier, denses réseaux neurones et système vasculaire ont été visualisées dans les récentes études9,10,11,12 avec l’imagerie 3D volume. En effet, il est essentiel d’étudier la biologie d’étudier la plasticité neuronale et vasculaire du tissu adipeux dans différentes conditions physiologiques. Imagerie en trois dimensions compatibles immunomarquage de compensation des tissus organes cote de solvant (iDISCO +) est un processus composé de prétraitement de méthanol, immunomarquage et dégagement d’opacité des tissus avec des réactifs chimiques organiques dichlorométhane (DCM ) et de dibenzyle éther (DBE)13,14. En rendant le tissu adipeux entièrement transparente, une représentation plus précise de l’anatomie dans les tissus tels que les vaisseaux sanguins et fibres neurales peut être obtenue à9,10. IDISCO + a des avantages car il est compatible avec divers anticorps et reporters fluorescent11,14, et il a démontré le succès dans plusieurs organes et même embryonnés14. Cependant, sa principale limitation est un temps d’incubation longue, dont 18 à 20 jours sont nécessaires pour compléter l’expérience entière.
Une autre application importante d’entier-Montez la souillure est la visualisation du sort de la cellule en combinaison avec un système de traçage de lignage. Suivi de lignée est l’étiquetage d’un gène spécifique/marqueur dans une cellule qui peut être transmis à toutes les cellules de fille et est conservée au fil du temps15. Par conséquent, il est un outil puissant qui peut être utilisé pour déterminer le sort de progéniture15 une cellule. Depuis les années 1990, le système de recombinaison Cre-LoxP est devenu une approche puissante pour le traçage de la lignée dans la vie des organismes15. Quand une lignée de souris qui exprime la Cre, une enzyme de recombinase ADN, est croisée avec une autre lignée de souris exprimant un journaliste qui est adjacent à une séquence de STOP-loxP-loxP, la protéine de journaliste est exprimée15.
Entier-Montez la souillure, l’utilisation de reporters multicolores fluorescents est adaptée pour l’imagerie du tissu adipeux, parce qu’il permet une interférence minimale avec activités intracellulaires de l’ adipocyte16. Cependant, les journalistes traditionnels tachent généralement le cytoplasme, rendant difficile de remonter la lignée des adipocytes blancs, qui ont peu de contenu cytoplasmique17. Pour contourner ce problème, l’utilisation du marqueur de journaliste membranaires fluorescents tdTomato/membrane eGFP (mT/mG) est un outil idéal. Axés sur la membrane tdTomato est exprimée en Cre-négatif cellules18. À l’excision, le Cre un interrupteur pour l’expression de membrane ciblées eGFP survient, ce qui rend ce journaliste appropriés pour le suivi de la lignée des adipocytes progéniteurs17,18 (Complémentaire de la Figure 1).
Le but de cet article est de fournir un protocole détaillé pour entier-Montez la souillure et de montrer comment elle peut être combinée avec d’autres techniques pour étudier le développement et la physiologie du tissu adipeux. Son utilisation avec des lignées de souris journaliste 1) multicolore pour identifier les origines diverses des adipocytes et 2) tissus de compensation pour visualiser davantage l’arborisation neurale dans le tissu adipeux blanc (WAT) en sont deux exemples d’applications décrites dans le présent protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les techniques classiques telles que l’histologie et cryosection offrent des avantages pour l’observation de la structure intracellulaire, entier-Montez la souillure offre une perspective différente dans la recherche de tissu adipeux, qui permet de visualiser en 3D des cellulaires architecture du tissu minimalement transformé.
Afin de réaliser avec succès entier-Montez la souillure, les suggestions suivantes devraient prendre en considération. Dépôts adipeux différents peu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des dons des Sciences naturelles et du Conseil de recherche génie (CRSNG) du Canada, pilote et faisabilité étude Grant de Banting et Best diabète Centre (BBDC), le Fonds de démarrage de SickKids à H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science, les TIC et Future planification à J-R.K.
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
