הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר
Summary
המוקד של המחקר הנוכחי הוא להמחיש את כולה-הר immunostaining והדמיה הטכניקה כשיטת אידיאלי עבור הדמיה תלת-ממדית של רכיב סלולרי ואדריכלות רקמת שומן.
Abstract
רקמת שומן הוא איבר חשוב מטבולית עם פלסטיות גבוה, והוא מגיב לגירויים סביבתיים, מזין מעמד. ככזה, טכניקות שונות פותחו כדי ללמוד על מורפולוגיה וביולוגיה של רקמת שומן. עם זאת, שיטות הדמיה קונבנציונאלי מוגבלות ללמוד את הרקמה בסעיפים 2D, נכשל ללכוד את הארכיטקטורה תלת-ממד של האיבר כולו. כאן אנו מציגים כולה-הר מכתים, שיטה אימונוהיסטוכימיה ששומרת מורפולוגיה רקמת שומן ללא פגע עם שלבי עיבוד מינימלי. לפיכך, המבנים של adipocytes ורכיבים אחרים התאית נשמרים ללא עיוות, השגת את קנאס לוויזואליזציה תלת-ממדית של הרקמה. בנוסף, כולה-הר מכתים יכול להיות משולב עם שושלת היוחסין שיטות מעקב כדי לקבוע החלטות גורל התא. עם זאת, טכניקה זו יש כמה מגבלות לספק מידע מדויק לגבי בחלק העמוק של רקמת שומן. כדי להתגבר על מגבלה זו, כולה-הר מכתים יכול להיות משולב עם עוד רקמות ניקוי טכניקות כדי להסיר את opaqueness של רקמת ולאפשר הדמיה מלאה של אנטומיה כולה רקמת שומן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליונות. לכן, רזולוציה גבוהה יותר וייצוג מדויקת יותר של רקמת שומן מבנים ניתן ללכוד עם השילוב של טכניקות אלה.
Introduction
רקמת שומן הוא איבר חיוני עבור אחסון אנרגיה, מאופיין על-ידי נערכו דינמי והרחבת כמעט ללא הגבלה1. בנוסף אנרגיה הומאוסטזיס, רקמת שומן גם ממלא תפקיד חיוני הפרשת הורמון adipokines מעל 50 לווסת פונקציה מטבולית לכל הגוף2. רקמת שומן יש של ארכיטקטורה מגוונת הכוללת של סוגי תאים שונים לרבות adipocytes בוגר, fibroblasts, תאי אנדותל, תאים חיסוניים adipocyte קדמון תאים3. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השמנת יתר, תפקוד מטבולי אחר יכול לשנות משמעותית את תפקוד רקמת שומן ואת microenvironment שלו, אשר כולל אך אינו מוגבל להגדלה של adipocytes, חדירה של תאים דלקתיים (למשל, macrophages), ותפקוד כלי הדם3.
טכניקות מורפולוגי שגרתיות כגון היסטולוגיה ו- cryosectioning להדגים מספר מגבלות ללמוד ביולוגיה אדיפוז כגון שלבי עיבוד כימי ממושך, אשר יכול להוביל רקמות הצטמקות ומבנה עיוות3, 4. יתר על כן, טכניקות 2D אלה אינם מספיקים לקיים אינטראקציות המערכת שהופעל על ידי סוגי תאים שונים, כמו הסעיפים שהושגו מוגבלת לאזורים קטנים יותר של רקמת כולה3. בהשוואה לקונבנציונלי שיטות הדמיה פלורסנט, כולה-הר מכתים אינה דורשת שלבים פולשניים נוספים, כגון הטבעה, חלוקתה, התייבשות; לכן, זה מונע את הבעיה של צמצום נוגדן ירידה לפרטים. ככזו, היא שיטה פשוטה ויעילה עבור הדמיה רקמת שומן, עם שימור טוב יותר של רקמת שומן הכולל מבנה5ומורפולוגיה adipocyte. לכן, כל הר מכתים כל טכניקה מהירה וזולה immunolabeling הוקם כדי לשמר את רקמת שומן ארכיטקטורה תלת-ממד1,6,7,8.
עם זאת, למרות שימור רקמת שומן מורפולוגיה עם השימוש כולה-הר מכתים, טכניקה זו היא עדיין מסוגלים לדמיין את המבנים הפנימיים מתחת לפני השטח השומנים של הרקמה. מספר האחרונות מחקרים9,10 הקימו רקמות ניקוי טכניקות בשילוב עם1,כולה-הר immunolabeling6 כדי לאפשר לוויזואליזציה תלת-ממדית מקיפה בתוך רקמת שומן. בפרט, רשתות עצביות, להערכת צפופה היו דמיינו האחרונות מחקרים9,10,11,12 עם הדמיה תלת-ממדי. אכן, לומד את פלסטיות עצבית ואת כלי הדם של רקמת שומן בתנאים פיזיולוגיים שונים חיוני ללמוד ביולוגיה שלה. מאופשר Immunolabeling הדמיה תלת-ממדית של ניקוי רקמות איברים הממס-והפנים (iDISCO +) הוא תהליך מורכב של מתנול קדם טיפול, immunolabeling, וניקוי של רקמת opaqueness עם ריאקטיבים כימיים אורגניים דיכלורומתאן (DCM ) ו dibenzyl (אנגלית) אתר13,14. על ידי ביצוע של רקמת שומן שקוף לחלוטין, ייצוג מדויק יותר של האנטומיה בתוך רקמת הדם ו סיבים עצביים ניתן להשיג9,10. IDISCO + יש יתרונות בכך שהוא תואם נוגדנים שונים,11,כתבים פלורסנט14, זה הוכיח הצלחה איברים מרובים, אפילו embryoes14. עם זאת, מגבלה הראשי שלה הוא זמן דגירה ארוך, שבו 18-20 ימים יש צורך להשלים את הניסוי כולו.
יישום חשוב נוסף של צביעת כולה-הר הוא הפריט החזותי של גורל בשילוב עם מערכת מעקב אחר שושלת היוחסין. מעקב אחר שושלת היוחסין היא תוויות של הגן/סמן ספציפי בתא ניתן להעביר כל התאים הבת, כולו מעל הזמן15. ככזה, הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי לקבוע את גורלו של רומא התא15. מאז שנות ה-90, המערכת רקומביננטי Cre-LoxP הפכה בגישה רב-עוצמה עבור מעקב אחר שושלת היוחסין חי אורגניזמים15. כאשר קו העכבר המבטאת Cre, אנזים recombinase ה-DNA, הוא חצה עם קו אחר העכבר לבטא כתב הסמוכה לרצף loxP-עצור-loxP, החלבון הכתב הוא ביטוי15.
עבור כל-הר מכתים, השימוש של כתבים ססגוניות פלורסנט מתאים הדמיה של רקמת שומן, כי זה מאפשר התערבות מינימלית עם פעילויות תאיים של adipocyte ה-16. עם זאת, כתבים מסורתיים בדרך כלל כתם הציטופלסמה, ולכן קשה לאתר את שושלת היוחסין של לבן adipocytes, אשר מוגבלת תוכן cytoplasmic17. כדי להתגבר על בעיה זו, השימוש של קרום מכורך פלורסנט tdTomato/ממברנה eGFP (mT/מ ג) כתב סמן הוא כלי אידיאלי. TdTomato, ממוקדות ממברנה מתבטא Cre-שלילי תאים18. על כריתה Cre, לעבור הביטוי של eGFP, ממוקדות ממברנה מתרחש, שהופך את הכתב מתאים לאתר את שושלת היוחסין של adipocyte אבות17,18 (איור משלים 1).
מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט עבור כל-הר מכתים ולהראות איך זה יכול להיות משולב עם טכניקות אחרות ללמוד פיתוח, הפיזיולוגיה של רקמת שומן. שתי דוגמאות של יישומים שמתואר פרוטוקול זה הם השימוש עם הכתב 1) ססגוניות קווים העכבר כדי לזהות את המקורות השונים של adipocytes ו- 2) רקמת ניקוי להמחיש עוד יותר את arborization עצבית של שומן לבן (וואט).
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות טכניקות שגרתיות כגון היסטולוגיה ו- cryosection להציע יתרונות להתבוננות מבנה תאיים, כולה-הר מכתים מספק נקודת מבט שונה במחקר רקמת שומן, המאפשרת הדמיה תלת-ממדית של הסלולרי ארכיטקטורה של רקמות מינימלית מעובד.
על מנת לבצע בהצלחה את כולה-הר מכתים, ההצעות הבאות צריכה להילקח בחשבו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי מענקים מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC) של קנדה, טייס, מענק מחקר היתכנות של בנטינג & הטוב סוכרת במרכז (BBDC), לקרן סטארט-אפ SickKids H-ק’ ס’, רפואי מרכז תכנית המחקר (2015R1A5A2009124) דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע, תקשוב, העתיד מתכנן J-ר. ק
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
