3 डी सफेद वसा ऊतक संरचना के दृश्य का उपयोग कर पूरे माउंट धुंधला
Summary
वर्तमान अध्ययन का ध्यान वसा ऊतक वास्तुकला और सेलुलर घटक के 3 डी इमेजिंग के लिए एक आदर्श विधि के रूप में पूरे माउंट immunostaining और दृश्य तकनीक का प्रदर्शन है ।
Abstract
वसा ऊतक उच्च प्लास्टिक के साथ एक महत्वपूर्ण चयापचय अंग है और पर्यावरण उत्तेजनाओं और पोषक तत्वों की स्थिति के लिए उत्तरदायी है । जैसे, विभिंन तकनीकों वसा ऊतक विज्ञान और जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । हालांकि, पारंपरिक दृश्य विधियों 2d वर्गों में ऊतक का अध्ययन करने के लिए सीमित हैं, पूरे अंग के 3 डी वास्तुकला पर कब्जा करने में विफल । यहाँ हम पूरे-धुंधला माउंट, एक immunohistochemistry विधि है कि न्यूनतम प्रसंस्करण कदम के साथ बरकरार वसा ऊतक आकृति विज्ञान संरक्षित करता है उपस्थित । इसलिए, adipocytes और अंय सेलुलर घटकों की संरचनाओं विरूपण के बिना बनाए रखा, ऊतक के सबसे प्रतिनिधि 3 डी दृश्य प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, पूरे माउंट धुंधला वंश अनुरेखण तरीके सेल भाग्य निर्णय निर्धारित करने के साथ जोड़ा जा सकता है । हालांकि, इस तकनीक वसा ऊतक के गहरे भागों के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करने के लिए कुछ सीमाएं हैं । इस सीमा पर काबू पाने के लिए, पूरे-धुंधला आगे ऊतक समाशोधन तकनीक के साथ संयुक्त करने के लिए ऊतक की अपारदर्शी हटाने और पूरे वसा ऊतक शरीर रचना विज्ञान के पूर्ण दृश्य के लिए अनुमति प्रकाश-पत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सकते हैं । इसलिए, एक उच्च संकल्प और वसा ऊतक संरचनाओं के अधिक सटीक प्रतिनिधित्व इन तकनीकों के संयोजन के साथ कब्जा किया जा सकता है ।
Introduction
वसा ऊतक ऊर्जा भंडारण के लिए एक आवश्यक अंग है और गतिशील पुननिर्माण और लगभग असीमित विस्तार1की विशेषता है । ऊर्जा homeostasis के अलावा, वसा ऊतक भी पूरे शरीर चयापचय समारोह2मिलाना करने के लिए ५० से अधिक adipokines के हार्मोन स्राव में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । वसा ऊतक एक विविध वास्तुकला परिपक्व adipocytes, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और adipocyte जनक कोशिकाओं3सहित विभिन्न प्रकार के सेल के शामिल है । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि मोटापा और अंय चयापचय रोग काफी वसा ऊतक समारोह और उसके microenvironment है, जो भी शामिल है बदल सकते हैं, लेकिन adipocytes की वृद्धि तक ही सीमित नहीं है, भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ (जैसे, मैक्रोफेज), और संवहनी रोग3.
इस तरह के प्रोटोकॉल और cryosectioning के रूप में पारंपरिक रूपात्मक तकनीक वसा जीव विज्ञान जैसे लंबा रासायनिक प्रसंस्करण कदम है, जो ऊतक संकोचन और संरचना विरूपण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में अध्ययन में कई सीमाएं प्रदर्शित करता है3, 4. इसके अलावा, इन 2 डी तकनीक अलग सेल प्रकार द्वारा लागू सेलुलर बातचीत का पालन करने के लिए अपर्याप्त हैं, के रूप में प्राप्त वर्गों पूरे3ऊतक के छोटे क्षेत्रों तक ही सीमित हैं । फ्लोरोसेंट इमेजिंग के पारंपरिक तरीकों की तुलना में, पूरे-धुंधला दाग ऐसे embedding, अनुभाग, और निर्जलीकरण के रूप में अतिरिक्त इनवेसिव कदम, की आवश्यकता नहीं है; इस प्रकार, यह एंटीबॉडी विशिष्टता कम की समस्या से बचा जाता है । जैसे, यह इमेजिंग वसा ऊतक के लिए एक सरल और कुशल विधि है, adipocyte आकृति विज्ञान और समग्र वसा ऊतक संरचना5के बेहतर संरक्षण के साथ । इसलिए, पूरे-एक त्वरित और सस्ती immunolabeling तकनीक के रूप में धुंधला माउंट वसा ऊतक 3 डी वास्तुकला1,6,7,8के संरक्षण के लिए स्थापित किया गया था ।
हालांकि, पूरे-माउंट धुंधला के उपयोग के साथ वसा ऊतक आकृति विज्ञान के संरक्षण के बावजूद, इस तकनीक अभी भी ऊतक के लिपिड सतह के नीचे भीतरी संरचनाओं कल्पना करने में असमर्थ है । कई हाल के अध्ययन9,10 पूरे-माउंट immunolabeling1,6 वसा ऊतक के भीतर व्यापक 3 डी दृश्य के लिए अनुमति देने के साथ संयुक्त ऊतक समाशोधन तकनीक की स्थापना की है । विशेष रूप से, घने तंत्रिका और vasculature नेटवर्क हाल ही में अध्ययन में visualized थे9,10,11, 3 डी मात्रा इमेजिंग के साथ । वास्तव में, विभिंन शारीरिक स्थितियों के तहत वसा ऊतक के तंत्रिका और संवहनी प्लास्टिक का अध्ययन करने के लिए अपने जीव विज्ञान की पढ़ाई जरूरी है । Immunolabeling-सक्षम तीन आयामी विलायक-खाली अंगों की इमेजिंग (iDISCO +) ऊतक समाशोधन एक प्रक्रिया है मेथनॉल पूर्व उपचार, Immunolabeling के शामिल है, और जैविक रासायनिक रिएजेंट के साथ ऊतक अपारदर्शीता के समाशोधन dichloromethane (डीसीएम ) और dibenzyl ईथर (DBE)13,14. वसा ऊतक पूरी तरह से पारदर्शी बनाने के द्वारा, रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के रूप में ऊतक के भीतर शरीर रचना विज्ञान के एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व9,10प्राप्त किया जा सकता है । IDISCO + में है कि यह विभिंन एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट11,14पत्रकारों के साथ संगत है लाभ है, और यह कई अंगों और यहां तक कि14भ्रूण में सफलता का प्रदर्शन किया है । हालांकि, इसकी मुख्य सीमा एक लंबी मशीन का समय है, जिसमें 18 से 20 दिन पूरे प्रयोग को पूरा करने के लिए आवश्यक हैं ।
पूरे की एक और महत्वपूर्ण आवेदन-धुंधला माउंट एक वंश अनुरेखण प्रणाली के साथ संयोजन में सेल भाग्य का दृश्य है । वंश अनुरेखण एक विशिष्ट जीन के लेबल है कि सभी बेटी कोशिकाओं पर पारित किया जा सकता है और15समय के साथ संरक्षित है एक सेल में मार्कर/। जैसे, यह एक शक्तिशाली उपकरण है कि एक कोशिका की संतान15के भाग्य का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 1990 के दशक के बाद से, Cre-LoxP रिकॉमबिनेंट प्रणाली15जीवों रहने में वंश अनुरेखण के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बन गया है । जब एक माउस लाइन कि Cre, एक डीएनए recombinase एंजाइम व्यक्त करता है, एक और माउस एक रिपोर्टर है कि एक loxP-रोक-loxP अनुक्रम के निकट है व्यक्त लाइन के साथ पार कर रहा है, रिपोर्टर प्रोटीन15व्यक्त की है ।
पूरे-धुंधला माउंट के लिए, फ्लोरोसेंट बहुरंगा पत्रकारों का उपयोग वसा ऊतक की इमेजिंग के लिए उपयुक्त है, क्योंकि यह adipocyte16के intracellular गतिविधियों के साथ ंयूनतम हस्तक्षेप के लिए अनुमति देता है । हालांकि, पारंपरिक संवाददाताओं आम तौर पर कोशिका द्रव्य दाग, यह मुश्किल सफेद adipocytes, जो cytoplasmic17सामग्री सीमित है की वंश का पता लगाने के लिए बना । इस समस्या को दूर करने के लिए, झिल्ली के प्रयोग से बंधे फ्लोरोसेंट tdTomato/झिल्ली eGFP (mT/मिलीग्राम) रिपोर्टर मार्कर एक आदर्श उपकरण है । झिल्ली-लक्षित tdTomato Cre-नकारात्मक कोशिकाओं18में व्यक्त की है । Cre उत्पाद पर, झिल्ली की अभिव्यक्ति के लिए एक स्विच-लक्षित eGFP होता है, इस रिपोर्टर adipocyte progenitors17,18 (अनुपूरक चित्रा 1) की वंशावली अनुरेखण के लिए उपयुक्त बना ।
इस कागज के उद्देश्य के लिए पूरे के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल-धुंधला और दिखाने के लिए यह कैसे अंय तकनीकों के साथ संयुक्त किया जा सकता है के विकास और वसा ऊतक फिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए प्रदान करना है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित अनुप्रयोगों के दो उदाहरण के साथ इसके उपयोग कर रहे है 1) बहुरंगा रिपोर्टर माउस लाइनों को adipocytes और 2 के विभिंन मूल की पहचान) ऊतक समाशोधन के लिए आगे सफेद वसा ऊतक (वाट) में तंत्रिका arborization कल्पना ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि ऐसे प्रोटोकॉल और cryosection intracellular संरचना, पूरे-धुंधला माउंट के लिए प्रस्ताव लाभ के रूप में पारंपरिक तकनीक वसा ऊतक अनुसंधान, जो सेलुलर के 3 डी दृश्य में सक्षम बनाता है में एक अलग परिप्रेक्ष्य प्रदान करत…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), बंटिंग एंड बेस्ट डायबिटीज सेंटर (BBDC) के पायलट और व्यवहार्यता अध्ययन अनुदान, SickKids स्टार्ट-अप फंड से एच-कश्मीर तक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. एस., मेडिकल रिसर्च सेंटर प्रोग्राम (2015R1A5A2009124) कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) के माध्यम से वित्त पोषित विज्ञान मंत्रालय, आईसीटी, और भविष्य की योजना के लिए जम्मू-आर. के.
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
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