Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto
Summary
L’obiettivo del presente studio è di dimostrare la tecnica immunostaining e visualizzazione di intero-monta come un metodo ideale per l’imaging 3D della componente cellulare e architettura del tessuto adiposo.
Abstract
Tessuto adiposo è un organo metabolico importante con alta plasticità ed è sensible a reagire agli stimoli ambientali e stato nutrizionale. Come tale, le varie tecniche sono state sviluppate per studiare la morfologia e la biologia del tessuto adiposo. Tuttavia, metodi di visualizzazione convenzionale sono limitati a studiare il tessuto nelle sezioni 2D, non riuscendo a catturare l’architettura 3D dell’intero organo. Qui presentiamo intero-monta la macchiatura, un metodo di immunohistochemistry che conserva intatto il tessuto adiposo morfologia con passaggi di elaborazione minima. Quindi, le strutture di adipociti e altri componenti cellulari sono mantenute senza distorsione, ottenendo la visualizzazione 3D più rappresentativo del tessuto. Inoltre, intero-monta la macchiatura combinabile con metodi di analisi di lignaggio per determinare le decisioni di destino delle cellule. Tuttavia, questa tecnica ha alcune limitazioni a fornire informazioni accurate per quanto riguarda le parti più profonde del tessuto adiposo. Per ovviare a questa limitazione, intero-monta la macchiatura possa essere ulteriormente combinata con tessuto tecniche per rimuovere l’opacità del tessuto e consentire la visualizzazione completa dell’intero tessuto adiposo anatomia usando microscopia fluorescente luce-foglio di compensazione. Di conseguenza, una maggiore risoluzione e più accurata rappresentazione delle strutture di tessuto adiposo può essere catturati con la combinazione di queste tecniche.
Introduction
Tessuto adiposo è un organo essenziale per la conservazione di energia ed è caratterizzato da dinamiche di rimodellamento e quasi illimitata espansione1. Oltre l’omeostasi energetica, tessuto adiposo inoltre svolge un ruolo essenziale nella secrezione dell’ormone di adipochine oltre 50 di modulare la funzione metabolica del corpo intero2. Tessuto adiposo ha una diversa architettura composta da vari tipi cellulari tra cui adipocytes maturi, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule immunitarie e di cellule progenitrici del adipocyte3. Recenti studi hanno dimostrato che l’obesità e altre disfunzioni metaboliche possono alterare significativamente funzione del tessuto adiposo e suo microambiente, che include ma non è limitato all’allargamento degli adipociti, infiltrazione di cellule infiammatorie (per esempio, macrofagi) e disfunzione vascolare3.
Tecniche convenzionali morfologiche come l’istologia e cryosectioning dimostrano diverse limitazioni nello studiare biologia adiposo come passaggi di elaborazione chimica di lunga durata, che può portare a tessuto restringimento e struttura distorsione3, 4. Inoltre, queste tecniche 2D sono insufficienti per osservare interazioni intercellulari esercitate da diversi tipi di cellule, come le sezioni ottenute sono limitate a regioni più piccole dell’ intero tessuto3. Rispetto ai convenzionali metodi di imaging fluorescente, intero-monta la macchiatura non richiede ulteriori misure invasive, quali l’incorporamento, sezionamento e disidratazione; così, questo evita il problema della specificità dell’anticorpo in diminuzione. Come tale, è un metodo semplice ed efficace per formazione immagine del tessuto adiposo, con migliore conservazione della morfologia degli adipociti e complessiva del tessuto adiposo struttura5. Di conseguenza, intero-monta colorazione come una tecnica di immunolabeling veloce e poco costoso è stata istituita per preservare il tessuto adiposo 3D architettura1,6,7,8.
Tuttavia, nonostante la conservazione della morfologia del tessuto adiposo con uso di intero-monta la macchiatura, questa tecnica è ancora in grado di visualizzare le strutture interne sotto la superficie del lipido del tessuto. Diversi recenti studi9,10 hanno stabilito del tessuto tecniche combinate con intero-monta immunolabeling1,6 per consentire per la completa visualizzazione 3D all’interno del tessuto adiposo di compensazione. In particolare, sono state visualizzate fitte reti neurali e sistema vascolare in recenti studi9,10,11,12 con imaging con volumi 3D. Infatti, studiando la plasticità neurale e vascolare del tessuto adiposo in differenti condizioni fisiologiche è essenziale per studiare la biologia. Imaging tridimensionale abilitati su immunolabeling di schiarimento del tessuto ha eliminato solvente organi (iDISCO +) è un processo composto da pre-trattamento di metanolo, immunolabeling e di compensazione di opacità del tessuto con reagenti chimici organici diclorometano (DCM ) e dibenzyl ether (DBE)13,14. Il tessuto adiposo rendendo completamente trasparente, una rappresentazione più accurata dell’anatomia all’interno del tessuto come vasi sanguigni e fibre nervose possa essere ottenuta9,10. IDISCO + ha vantaggi in quanto è compatibile con vari anticorpi e reporter fluorescenti11,14, ed è dimostrato successo in molteplici organi e ritrovati anche14. Tuttavia, il suo limite principale è un tempo di incubazione lungo, in cui 18 a 20 giorni sono necessari per completare l’intero esperimento.
Un’altra importante applicazione della intero-monta la macchiatura è la visualizzazione di destino delle cellule in combinazione con un sistema di tracciatura di lignaggio. Lignaggio traccia è l’etichettatura di un gene/indicatore specifico in una cella può essere passato a tutte le cellule della figlia, che è conservato nel tempo15. Come tale, è un potente strumento che può essere utilizzato per determinare il destino di progenie15 di una cellula. Dal 1990, il sistema ricombinante di Cre-LoxP è diventato un potente approccio per l’analisi di lignaggio in vita organismi15. Quando una linea di topo che esprime Cre, un enzima recombinase di DNA, è attraversata con un’altra linea di mouse che esprimono un reporter che è adiacente a una sequenza di loxP-STOP-loxP, la proteina reporter è espresso15.
Per intero-monta la colorazione, l’uso di reporter fluorescenti multicolor è adatto per formazione immagine del tessuto adiposo perché permette per la minima interferenza con attività intracellulare del adipocyte16. Tuttavia, reporter tradizionale in genere macchia il citoplasma, rendendo difficile rintracciare la discendenza di adipociti bianchi, che hanno limitato contenuto citoplasmico17. Per ovviare a questo problema, l’uso di marker di membrana-limitano fluorescente tdTomato/membrana eGFP (mT/mG) reporter è uno strumento ideale. Targeting per membrana tdTomato è espresso in Cre-negativo cellule18. Sull’asportazione di Cre, si verifica un interruttore per l’espressione di eGFP membrana-mirati, rendendo questo reporter adatto per rintracciare il lignaggio del adipocyte progenitori17,18 (Complementare figura 1).
Lo scopo di questa carta è quello di fornire un protocollo dettagliato per intero-monta la macchiatura e mostrare come può essere combinato con altre tecniche per studiare lo sviluppo e la fisiologia del tessuto adiposo. Due esempi di applicazioni descritte in questo protocollo sono suo uso con linee del mouse 1) multicolor reporter per identificare origini diverse di adipociti e 2) tessuto di compensazione per visualizzare ulteriormente il arborization neurale nel tessuto adiposo bianco (WAT).
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se le tecniche convenzionali come l’istologia e donatrici offrono benefici per osservando struttura intracellulare, intero-monta la macchiatura offre una prospettiva diversa nella ricerca del tessuto adiposo, che consente la visualizzazione in 3D del cellulare architettura del tessuto minimamente trasformato.
Per eseguire correttamente la macchiatura intero-monta, i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Depositi di differenti del tessuto adiposo possono produrr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC) del Canada, pilota e Grant di studio di fattibilità di Banting e Best diabete centro (PPMI), il fondo iniziale di SickKids a H-K. S., Medical Research Center programma (2015R1A5A2009124) attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro progettando di J-R.K.
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
