Visualisering av 3D hvit fettvev struktur med hele-mount flekker

Summary

Fokus for studien er å vise hele-mount immunostai- og visualisering teknikken som en ideell metode for 3D-bildebehandling av fettvev arkitektur og cellular komponenten.

Abstract

Fettvev er et viktig metabolsk organ med høy plastisitet og svarer til miljømessige stimuli og næringsstoffer status. Som sådan, er ulike teknikker utviklet for å studere morfologi og biologi av fettvev. Men er konvensjonelle visualisering metoder begrenset til å studere vevet i 2D deler, unnlater å fange 3D arkitektur hele orgel. Her presenterer vi hele-mount flekker, en immunohistochemistry metode som beholder intakt fettvev morfologi med minimal behandlingstrinnene. Dermed opprettholdes konstruksjoner av adipocytter og andre cellulære komponenter uten forvrengning, oppnå mest representative 3D-visualisering av vev. I tillegg kan hele-mount flekker kombineres med avstamning sporing metoder for å bestemme cellen skjebne beslutninger. Denne teknikken har imidlertid noen begrensninger til å gi nøyaktig informasjon om dypere deler av fettvev. For å overkomme denne begrensningen, kan hele-mount flekker videre kombineres med vev clearing teknikker for å fjerne opaqueness av vev og tillater fullstendig oversikt over hele fettvev anatomi bruker lys arks fluorescerende mikroskopi. Derfor kan en høyere oppløsning og mer nøyaktig gjengivelse av fettvev strukturer hentes med kombinasjonen av disse teknikkene.

Introduction

Fettvev er et viktig organ for energilagring og er preget av dynamisk ombygging og nesten ubegrenset utvidelse¹. I tillegg til energi homeostase spiller fettvev også en viktig rolle i hormon sekresjonen over 50 endotelial å modulere hele kroppen metabolsk funksjon². Fettvev har en variert arkitektur består av forskjellige celletyper inkludert eldre adipocytter, fibroblaster, endotelceller, immunceller og adipocyte stamfar celler³. Nyere studier har vist at fedme og andre metabolsk dysfunksjon kan betydelig endre fettvev funksjon og dens microenvironment, som inkluderer men er ikke begrenset til utvidelse av adipocytter, infiltrasjon av inflammatoriske celler (f.eks makrofager), og vaskulær dysfunksjon³.

Konvensjonelle morfologiske teknikker som histology og og kryosnitt vise flere begrensninger i å studere adipose biologi som lange kjemisk behandling skritt, som kan føre til vev krymping og struktur forvrengning^{3, 4}. Videre er disse 2D teknikkene ikke nok å observere intercellulære interaksjoner utøves av ulike celletyper, som delene innhentet er begrenset til mindre regioner av hele vev³. Forhold til konvensjonelle metoder for fluorescerende bildebehandling, hele-mount flekker ikke krever flere invasiv trinn, som innebygging, skjæring og dehydrering; Dermed unngår dette problemet minskende antistoff spesifisitet. Som sådan, er det en enkel og effektiv metode for bildebehandling fettvev, med bedre bevaring av adipocyte morfologi og generelle fettvev struktur⁵. Derfor hele-mount flekker som en rask og rimelig immunolabeling teknikk var etablert fettvev 3D arkitektur^1,6,7,8.

Men til tross for bevaring av fettvev morfologi med bruk av hele-mount flekker er denne teknikken fremdeles ikke kan visualisere indre strukturer under lipid overflaten av vev. Flere nyere studier^9,10 har etablert vev clearing teknikker kombinert med hele-mount immunolabeling^1,6 å gi omfattende 3D-visualisering i fettvev. Spesielt var tett nevrale og blodkar nettverk visualisert i nyere studier^9,10,11,12 med 3D-volum imaging. Faktisk er studere nevrale og vaskulær plastisitet av fettvev under ulike fysiologiske forhold viktig å studere sin biologi. Immunolabeling-aktivert tredimensjonale imaging av løsemiddel klarert organer (iDISCO +) vev clearing er en prosess består av metanol forbehandling, immunolabeling, og clearing av vev opaqueness med organisk kjemiske reagenser diklormetan (DCM ) og dibenzyl Eter (DBE)^13,14. Ved å gjøre fettvev helt gjennomsiktig, kan en mer nøyaktig gjengivelse av anatomi i vevet som blodkar og nevrale fibre fås^9,10. IDISCO + har fordeler i at det er kompatibelt med forskjellige antistoffer og fluorescerende journalister^11,14, og det har demonstrert suksess i flere organer og selv embryoes¹⁴. Men er den viktigste begrensningen en lang incubation periode, der 18 til 20 dager kreves for å fullføre hele eksperimentet.

Et annet viktig program for hele-mount flekker er visualisering av cellen skjebne i kombinasjon med en slektslinje sporing system. Avstamning sporing er merking av et bestemt gen/indikator i en celle som kan sendes videre til alle datter celler og er bevart over tid¹⁵. Som sådan, er det et kraftig verktøy som kan brukes til å avgjøre skjebnen til en celle avkom¹⁵. Siden 1990 grobunn-LoxP rekombinant systemet har blitt en kraftig metode for avstamning sporing i levende organismer¹⁵. Når en mus linje som uttrykker grobunn, en DNA recombinase enzym, er krysset med en annen mus linje uttrykke reporter som er til en loxP-STOP-loxP sekvens, er reporter protein uttrykt¹⁵.

For hele-mount flekker, er bruk av fluorescerende multicolor journalister egnet for imaging av fettvev fordi det gir minimale forstyrrelser med intracellulære aktiviteter adipocyte¹⁶. Men flekken tradisjonelle journalister vanligvis cytoplasma, gjør det vanskelig å spore slektslinje hvit adipocytter, som har begrenset cytoplasmatiske innhold¹⁷. Du løser dette problemet, er bruken av membran-bundet fluorescerende tdTomato/membran eGFP (mT/mG) reporter markør et ideelt verktøy. Membran målrettede tdTomato uttrykkes i grobunn-negativ celler¹⁸. På grobunn excision oppstår bytte til uttrykk for membran målrettede eGFP, gjør denne reporteren egnet for sporing slektslinje adipocyte progenitors^17,18 (Supplerende figur 1).

Formålet med denne utredningen er å gi en detaljert protokoll for hele-mount flekker og viser hvordan den kan kombineres med andre teknikker å studere utviklingen og fysiologi av fettvev. To eksempler på programmer som er beskrevet i denne protokollen er bruken med 1) multicolor reporter musen linjer å identifisere ulike opprinnelsen til adipocytter og 2) vev fjerne for å ytterligere visualisere den nevrale arborization i hvit fettvev (WAT).

Protocol

Alle eksperimentelle dyr protokoller ble godkjent av dyr omsorg komiteen av The Center for Phenogenomics (TCP) likedannet standarder for kanadiske Rådet for Animal Care. Mus ble opprettholdt på 12-h lys/mørke sykluser og leveres med gratis tilgang til vann og mat. 7 mnd gamle C57BL/6J mannlige mus ble brukt i hele-mount flekker eksperimentet. Merk: Avsnitt 1 til 2 er i kronologisk rekkefølge, del 3 er et valgfritt trinn rett etter avsnitt 1. Del 4 kan utføres for å analysere adipocyte st…

Representative Results

På grunn av skjørhet av fettvev, kan metoder som involverer flere behandlingstrinnene og snitting føre til skjemmende fettvev morfologi3 (figur 1A). Men kan hele-mount flekker beholde morfologi av adipocytter, sikrer nøyaktig tolkning av resultater (figur 1B). Over fiksering av fettvev fører til bindemiddel-indusert autofluorescence. Som vist i figur 2A, overlappe grønne og r…

Discussion

Selv om konvensjonelle teknikker som histology og cryosection fordeler for å observere intracellulær struktur, gir hele-mount flekker et annerledes perspektiv i fettvev forskning, som muliggjør 3D-visualisering av mobilnettet arkitekturen av minimalt prosesserte vev.

For å utføre hele-mount flekker, bør følgende forslag tas i betraktning. Forskjellige fettvev depoter kan gi ulike immunostai-resultater; dermed bør av fettvev depot brukes fastsettes først. For eksempel, er brun fettvev …

Materials

LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 primary antibody	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R confocal microscope	Nikon		Confocal microscope
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies	Jackson ImmunoResearch		Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BioSciences	553141
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dibenzyl-ether	Sigma-Aldrich	33630
Methanol	Fisher Chemical	A452-1
30% Hydrogen Peroxide	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Glycine	Sigma-Aldrich	J7126
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)