Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Summary

O foco do presente estudo é demonstrar a técnica de imunocoloração e visualização de toda a montagem como um método ideal para tratamento de imagens 3D do tecido adiposo celular e arquitetura de componente.

Abstract

Tecido adiposo é um órgão metabólico importante com alta plasticidade e é sensível ao status de nutrientes e estímulos ambientais. Como tal, desenvolveram-se várias técnicas para estudar a morfologia e biologia do tecido adiposo. No entanto, métodos de visualização convencionais limitam-se a estudar o tecido em seções 2D, falhando capturar a arquitetura 3D do órgão inteiro. Aqui nós apresentamos toda a montagem, um método de imuno-histoquímica que preserva a morfologia intacta tecido adiposo com etapas de processamento mínimo de coloração. Portanto, as estruturas de adipócitos e outros componentes celulares são mantidas sem distorção, alcançar a visualização em 3D mais representativa do tecido. Além disso, toda a montagem de coloração pode ser combinado com métodos de rastreamento de linhagem para determinar as decisões de destino de célula. No entanto, esta técnica tem algumas limitações para fornecer informações precisas sobre as partes mais profundas do tecido adiposo. Para contornar essa limitação, montagem de toda a mancha pode ainda ser combinada com tecido técnicas para remover a opacidade do tecido e permitir a completa visualização da anatomia de todo tecido adiposo usando microscopia fluorescente luz-folha de compensação. Portanto, uma maior resolução e uma representação mais precisa das estruturas de tecido adiposo podem ser capturados com a combinação dessas técnicas.

Introduction

Tecido adiposo é um órgão essencial para o armazenamento de energia e é caracterizado pela dinâmica de remodelação e expansão quase ilimitada¹. Além de homeostase de energia, o tecido adiposo também desempenha um papel essencial na secreção de hormônio de mais de 50 adipocinas para modular a função metabólica de corpo inteiro². Tecido adiposo tem uma arquitectura diversificada composta por vários tipos de células, incluindo os adipócitos maduros, fibroblastos, células endoteliais, células do sistema imunológico e de células progenitoras dos adipócitos³. Estudos recentes têm mostrado que a obesidade e outras disfunções metabólicas podem significativamente alterar função do tecido adiposo e seu microambiente, que inclui mas não está limitado ao alargamento dos adipócitos, infiltração de células inflamatórias (por exemplo, macrófagos) e disfunção vascular³.

Técnicas morfológicas convencionais como histologia e cryosectioning demonstram várias limitações em estudar Biologia adiposa como etapas longas processamento químico, que pode levar ao tecido encolhimento e estrutura distorção^{3, 4}. Além disso, estas técnicas 2D são insuficientes para observar interações intercelulares exercidas pelos diferentes tipos de células, como as seções obtidas são limitadas a pequenas regiões do tecido inteiro³. Em comparação com os convencionais métodos de imagem fluorescente, manchando toda a montagem não requer etapas adicionais invasivas, tais como incorporação, corte e desidratação; assim, isto evita o problema de diminuir a especificidade do anticorpo. Como tal, é um método simples e eficiente para o tecido adiposo de imagem, com melhor preservação da morfologia dos adipócitos e de estrutura de tecido adiposo total⁵. Portanto, toda a montagem coloração como uma técnica rápida e barata immunolabeling foi estabelecida para preservar o tecido adiposo arquitetura 3D^1,6,7,8.

No entanto, apesar da preservação da morfologia do tecido adiposo, com uso de coloração toda a montagem, esta técnica é ainda incapaz de visualizar estruturas internas sob a superfície de lipídios do tecido. Vários estudos recentes^9,10 estabeleceram tecido limpando técnicas combinadas com toda a montagem immunolabeling^1,6 , para permitir a visualização 3D abrangente no tecido adiposo. Em particular, redes neurais e a vasculatura densas foram visualizadas em recentes estudos^9,10,11,12 com imagem de volume 3D. Com efeito, estudar a plasticidade neural e vascular do tecido adiposo em diferentes condições fisiológicas é essencial para o estudo de sua biologia. Habilitado para Immunolabeling imagem tridimensional da clareira de tecidos de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO +) é um processo composto de pré-tratamento de metanol, immunolabeling e limpeza de opacidade de tecido com reagentes químicos orgânicos diclorometano (DCM ) e dibenzyl de^13,de éter (DBE)¹⁴. O tecido adiposo, tornando totalmente transparente, uma representação mais precisa da anatomia dentro do tecido, tais como os vasos sanguíneos e fibras neurais pode ser obtida^9,10. IDISCO + tem vantagens em que é compatível com vários anticorpos e repórteres fluorescente^11,14, e tem demonstrado sucesso em vários órgãos e embriões até¹⁴. No entanto, sua principal limitação é um tempo de incubação longa, em que 18 a 20 dias são necessários para completar todo o experimento.

Outra aplicação importante da mancha toda a montagem é a visualização do destino de célula em combinação com um sistema de rastreamento de linhagem. Rastreamento de linhagem é a rotulagem de um gene/marcador específico em uma célula que pode ser transmitida a todas as células da filha e é conservada ao longo do tempo,¹⁵. Como tal, é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para determinar o destino de progênie^{15 de uma célula}. Desde a década de 1990, o sistema de recombinação de Cre-LoxP tornou-se uma poderosa abordagem para rastreamento de linhagem em vida organismos¹⁵. Quando uma linha de rato que expressa Cre, uma enzima recombinase de DNA, é cruzada com uma outra linha de rato, expressando uma repórter que é adjacente a uma sequência de loxP-STOP-loxP, a proteína de repórter é expressa¹⁵.

Para a coloração de toda a montagem, o uso de repórteres multicoloridos fluorescentes é apropriado para a imagem do tecido adiposo, porque permite a mínima interferência com atividades intracelulares do adipócito¹⁶. No entanto, repórteres tradicionais normalmente mancham o citoplasma, tornando difícil traçar a linhagem dos adipócitos brancos, que têm limitado a conteúdo citoplasmático¹⁷. Para superar este problema, o uso do marcador de repórter eGFP (mT/mG) membrana-limite tdTomato fluorescente/membrana é uma ferramenta ideal. TdTomato membrana-alvo é expressa em células de Cre-negativo¹⁸. Após excisão de Cre, ocorre um interruptor para a expressão da membrana-alvo eGFP, tornando este repórter adequado para rastreamento da linhagem do adipócito progenitores^17,18 (Complementar a figura 1).

O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado para montagem em toda a coloração e mostrar como ele pode ser combinado com outras técnicas para estudar o desenvolvimento e a fisiologia do tecido adiposo. Dois exemplos de aplicativos descritos no presente protocolo são seu uso com linhas de rato 1) multicolor repórter para identificar várias origens de adipócitos e 2) tecido de compensação para visualizar mais a arborização neural no tecido adiposo branco (WAT).

Protocol

Todos os protocolos de animais experimentais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal do centro para Phenogenomics (TCP) em conformidade com as normas do Conselho canadense de cuidado Animal. Ratos foram mantidos em ciclos de 12 h claro/escuro e fornecidos com livre acesso à água e comida. 7 mês antiga C57BL/6J camundongos machos foram usados no experimento manchando toda a montagem. Nota: As seções 1 e 2 estão em ordem cronológica, com seção 3 sendo uma etapa opcional logo apó…

Representative Results

Devido a fragilidade do tecido adiposo, métodos que envolvem várias etapas de processamento e corte podem levar à desfiguração do tecido adiposo morfologia3 (figura 1A). No entanto, toda a montagem de coloração pode preservar a morfologia dos adipócitos, garantindo a exata interpretação dos resultados (figura 1B). Fixação do excesso de tecido adiposo leva a autofluorescência induzida pelo fixador. …

Discussion

Embora as técnicas convencionais como histologia e cryosection oferecem benefícios para observar a estrutura intracelular, manchando toda a montagem fornece uma perspectiva diferente na investigação de tecido adiposo, que permite a visualização 3D de celulares arquitetura do tecido minimamente processado.

Para com êxito executar toda a montagem de coloração, as sugestões a seguir devem ser tida em conta. Depósitos de diferentes de tecido adiposo podem produzir vários resultados de …

Materials

LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 primary antibody	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R confocal microscope	Nikon		Confocal microscope
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies	Jackson ImmunoResearch		Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BioSciences	553141
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dibenzyl-ether	Sigma-Aldrich	33630
Methanol	Fisher Chemical	A452-1
30% Hydrogen Peroxide	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Glycine	Sigma-Aldrich	J7126
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)