Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Summary

El objetivo del presente estudio es demostrar la técnica de inmunotinción y visualización de conjunto de montaje como un método ideal para la proyección de imagen 3D del componente celular y arquitectura de tejido adiposo.

Abstract

Tejido adiposo es un órgano metabólico importante con alta plasticidad y responde a estímulos ambientales y estado nutricional. Como tal, han desarrollado varias técnicas para estudiar la morfología y la biología del tejido adiposo. Sin embargo, métodos de visualización convencionales se limitan a estudiar el tejido en secciones 2D, pudiendo capturar la arquitectura 3D del órgano entero. Aquí presentamos el conjunto de montaje coloración, un método de inmunohistoquímica que conserva intacto el tejido adiposo morfología con pasos de proceso mínima. Por lo tanto, se mantienen las estructuras de los adipocitos y otros componentes celulares sin distorsión, lograr la visualización 3D más representativa del tejido. Además, Monte toda la coloración se puede combinar con métodos de rastreo de linaje para determinar las decisiones de destino celular. Sin embargo, esta técnica tiene algunas limitaciones para proporcionar información precisa con respecto a partes más profundas del tejido adiposo. Para superar esta limitación, todo Monte tinción más combinables con técnicas para eliminar la opacidad del tejido y permitir la visualización completa de la anatomía de todo el tejido adiposo mediante microscopía fluorescente luz-hoja de limpieza del tejido. Por lo tanto, una mayor resolución y una representación más precisa de las estructuras de tejido adiposo pueden ser capturados con la combinación de estas técnicas.

Introduction

Tejido adiposo es un órgano esencial para el almacenamiento de energía y se caracteriza por remodelación dinámica y expansión casi ilimitada¹. Además de homeostasis de energía, el tejido adiposo también juega un papel esencial en la secreción de la hormona de más de 50 adipokines para modular la función metabólica de todo el cuerpo². El tejido adiposo tiene una arquitectura diversa que consta de diversos tipos celulares como adipocitos maduros, fibroblastos, células endoteliales, células inmunes y adipocito progenitoras células³. Estudios recientes han demostrado que la obesidad y otra disfunción metabólica pueden alterar significativamente la función del tejido adiposo y su microambiente, que incluye pero no se limita a la ampliación de los adipocitos, infiltración de células inflamatorias (por ejemplo, los macrófagos) y disfunción vascular³.

Técnicas morfológicas convencionales como la histología y cryosectioning demuestran varias limitaciones en el estudio de Biología adiposo como pasos largos procesos químicos, que puede conducir a tejido estructura y contracción distorsión^{3, 4}. Además, estas técnicas 2D son insuficientes para observar las interacciones intercelulares ejercidas por diversos tipos celulares, como las secciones obtenidas se limitan a regiones más pequeñas del tejido entero³. Métodos en comparación con convencional de imágenes fluorescentes, todo montaje coloración no requiere de otras medidas invasivas, como inclusión, seccionamiento y deshidratación; por lo tanto, esto evita el problema de disminuir la especificidad del anticuerpo. Como tal, es un método sencillo y eficaz para la proyección de imagen el tejido adiposo, con mejor preservación de la morfología de los adipocitos y de estructura de tejido adiposo total⁵. Por lo tanto, todo montaje de tinción como una técnica rápida y barata de la inmunomarcación fue establecida para preservar tejido adiposo arquitectura 3D^1,6,7,8.

Sin embargo, a pesar de la preservación de la morfología del tejido adiposo con el uso de tinción montaje en conjunto, esta técnica es todavía incapaz de visualizar estructuras internas, debajo de la superficie lipídica de los tejidos. Varios recientes estudios^9,10 han creado tejido claro técnicas combinadas con inmunomarcación conjunto montaje^1,6 para permitir la visualización completa en 3D dentro del tejido adiposo. En particular, redes neuronales y vasculatura densas fueron visualizadas en reciente estudios^9,10,11,12 con la proyección de imagen de volumen 3D. De hecho, estudiando la plasticidad neural y vascular del tejido adiposo en diferentes condiciones fisiológicas es esencial para el estudio de su biología. Proyección de imagen tridimensional de inmunomarcación compatible de claro de tejido de órganos despejó de solvente (iDISCO +) es un proceso compuesto por tratamiento previo de metanol, inmunomarcación y claro de opacidad tejido con reactivos químicos orgánicos diclorometano (DCM ) y dibencilo éter (DBE)^13,14. Haciendo que el tejido adiposo totalmente transparente, puede obtenerse una representación más precisa de la anatomía dentro de los tejidos como vasos sanguíneos y fibras nerviosas^9,10. IDISCO + tiene ventajas en que es compatible con varios anticuerpos y Reporteros fluorescentes^11,14, y se ha demostrado éxito en múltiples órganos y embryoes hasta¹⁴. Sin embargo, su principal limitación es un tiempo de incubación, en el que 18 a 20 días se necesitan para completar todo el experimento.

Otra aplicación importante de montaje conjunto de tinción es la visualización del destino celular en combinación con un sistema de rastreo de linaje. Seguimiento del linaje es el etiquetado de un gen/marcador específico en una celda que puede transmitirse a todas las células de la hija y se conserva largo tiempo¹⁵. Como tal, es una poderosa herramienta que puede utilizarse para determinar el destino de la progenie de una célula¹⁵. Desde la década de 1990, sistema Cre-LoxP recombinante se ha convertido en un poderoso enfoque para seguimiento del linaje en la vida de los organismos¹⁵. Cuando una línea de ratón que expresa Cre, una enzima recombinase de ADN, se cruza con otra línea de ratón expresan un reportero que es adyacente a una secuencia loxP-parada-loxP, la proteína reportera es expresado¹⁵.

Para la tinción de todo montaje, el uso de fluorescentes reporteros multicoloras es adecuado para la proyección de imagen del tejido adiposo porque permite la interferencia mínima con actividades intracelulares del adipocito¹⁶. Sin embargo, reporteros tradicionales típicamente manchan el citoplasma, lo que es difícil rastrear el linaje de los adipocitos blancos, que tienen un limitado contenido citoplásmico¹⁷. Para superar este problema, el uso del marcador de membrana membrana tdTomato fluorescente eGFP (mT/mG) reporter es una herramienta ideal. Orientada a la membrana tdTomato se expresa en Cre-negativo células¹⁸. Sobre supresión de Cre, un interruptor para la expresión de eGFP orientada a la membrana se produce, lo que este reportero adecuado para rastrear el linaje del adipocito progenitores^17,18 (Complementario de la figura 1).

El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado para montaje en conjunto tinción y mostrar cómo se puede combinar con otras técnicas para estudiar el desarrollo y la fisiología del tejido adiposo. Dos ejemplos de aplicaciones descritas en este protocolo son su uso con líneas de ratón reportero 1) multicolor para identificar los distintos orígenes de los adipocitos y 2) tejido claro para visualizar más la arborización neuronal en el tejido adiposo blanco (WAT).

Protocol

Todos los protocolos experimentales de animales fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal del centro para Phenogenomics (TCP) se ajustó a las normas del Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal. Ratones fueron mantenidos en ciclos de luz/oscuridad de 12-h y con libre acceso a agua y alimentos. 7 meses viejos ratones machos C57BL/6J se utilizaron en el experimento de tinción montaje en conjunto. Nota: Las secciones 1 y 2 están en orden cronológico, con la sección 3 es un paso opc…

Representative Results

Debido a la fragilidad del tejido adiposo, métodos que implican varios pasos de procesamiento y seccionamiento pueden llevar a la desfiguración de tejido adiposo morfología3 (figura 1A). Sin embargo, el conjunto montaje coloración puede conservar la morfología de los adipocitos, garantizar la precisa interpretación de los resultados (figura 1B). Fijación excesiva de tejido adiposo lleva a autofluorescenc…

Discussion

Aunque las técnicas convencionales como la histología y criosección ofrecen beneficios para la observación de la estructura intracelular, conjunto Monte coloración proporciona una perspectiva diferente en la investigación de tejido adiposo, que permite la visualización en 3D de celular arquitectura del tejido mínimamente procesada.

Con el fin de realizar con éxito el montaje conjunto de tinción, las siguientes sugerencias deben tomarse en consideración. Depósitos de tejido adiposo …

Materials

LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 primary antibody	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R confocal microscope	Nikon		Confocal microscope
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies	Jackson ImmunoResearch		Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BioSciences	553141
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dibenzyl-ether	Sigma-Aldrich	33630
Methanol	Fisher Chemical	A452-1
30% Hydrogen Peroxide	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Glycine	Sigma-Aldrich	J7126
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)