Visualisering av 3D vit fettvävnad struktur med hjälp av hela-mount färgning
Summary
Fokus i den aktuella studien är att visa hela-mount immunfärgning och visualisering tekniken som en idealisk metod för 3D imaging av fettvävnad arkitektur och cellular komponent.
Abstract
Fettväv är ett viktigt metaboliska organ med hög plasticitet och är lyhörda för stimuli från omgivningen och näringsämnen status. Som sådan, har olika tekniker utvecklats för att studera morfologi och biologi av fettvävnad. Konventionella visualiseringsmetoder är dock begränsade till studera vävnaden i 2D sektioner, misslyckas att fånga 3D arkitekturen i hela orgeln. Här presenterar vi hela-mount färgning, en metod för immunhistokemi som bevarar intakta fettvävnad morfologi med minimal bearbetningssteg. Därför bibehålls strukturer adipocyter och andra cellulära komponenter utan distorsion, att uppnå den mest representativa 3D-visualiseringen av vävnad. Hela-mount färgning kan dessutom kombineras med lineage tracing metoder att avgöra cell öde beslut. Denna teknik har dock vissa begränsningar att tillhandahålla korrekt information om djupare delar av fettvävnad. För att kringgå den här begränsningen kan hela-mount färgning ytterligare kombineras med vävnad clearing tekniker för att ta bort svårtydd vävnad och möjliggöra komplett visualisering av hela fettvävnad anatomi med hjälp av ljus-ark fluorescerande mikroskopi. Därför kan en högre upplösning och mer exakt representation av fettvävnad strukturer fångas med kombinationen av dessa tekniker.
Introduction
Fettvävnad är ett viktigt organ för energilagring och kännetecknas av dynamiska ombyggnad och nästan obegränsad expansion1. Förutom energi homeostas spelar fettvävnad också en viktig roll i hormon utsöndringen av över 50 adipokines att modulera hela kroppen metabolisk funktion2. Fettvävnaden har en skiftande arkitektur bestående av olika celltyper inklusive mogen adipocyter, fibroblaster, endotelceller, immunceller och fettceller progenitor celler3. Nyare studier har visat att fetma och andra metabolisk dysfunktion kan markant ändra fettvävnad funktion och dess mikromiljö, som inkluderar men är inte begränsat till utvidgningen av adipocyter, infiltration av inflammatoriska celler (t.ex. makrofager), och vaskulär dysfunktion3.
Konventionella morfologiska tekniker såsom histologi och kryosnitt demonstrera flera begränsningar i studera fett biologi t ex långa kemisk bearbetningssteg, vilket kan leda till vävnad krympning och struktur distorsion det3, 4. Dessutom är dessa 2D tekniker otillräckliga för att följa intercellulära interaktioner utövas av olika celltyper, som de delar som erhålls är begränsad till mindre regioner av hela vävnad3. Jämfört med konventionella metoder för fluorescerande imaging, hela-mount färgning inte kräver ytterligare invasiva åtgärder, såsom inbäddning, snittning och uttorkning. således undviker detta problemet med minskande antikropp specificitet. Som sådan, är det en enkel och effektiv metod för imaging fettvävnad, med bättre bevarande av fettceller morfologi och övergripande fettvävnad struktur5. Därför, om hela-mount färgning som en snabb och billig immunolabeling teknik inrättades för att bevara fettvävnad 3D arkitektur1,6,7,8.
Men trots bevarandet av fettvävnad morfologi med användning av hela-mount färgning är denna teknik fortfarande inte att visualisera inre strukturer under lipid ytan av vävnaden. Flera senare studier9,10 har etablerat vävnad clearing tekniker kombineras med hela-mount immunolabeling1,6 som möjliggör omfattande 3D-visualisering inom fettvävnad. I synnerhet var tät neurala och kärlsystemet nät visualiseras i senaste studier9,10,11,12 med 3D-volym imaging. Studera de neurala och vaskulär plasticitet av fettvävnad under olika fysiologiska förhållanden är faktiskt nödvändigt att studera dess biologi. Immunolabeling-aktiverade tredimensionell avbildning av lösningsmedel-godkänt organ (iDISCO +) vävnad röjning är en process bestående av metanol förbehandling, immunolabeling, och clearing av vävnad svårtydd med organiska kemiska reagenser diklormetan (DCM ) och dibensyl eter (DBE)13,14. Genom att göra fettvävnaden helt transparent, kan en mer korrekt bild av anatomin i vävnaden som blodkärl och neurala fibrerna erhållas9,10. IDISCO + har fördelar i att den är kompatibel med olika antikroppar och fluorescerande reportrar11,14, och den har visat framgång i flera organ och även embryon14. Dess huvudsakliga begränsning är dock en lång inkubationstid, där 18 till 20 dagar för att slutföra hela experimentet.
En annan viktig tillämpning av hela-mount färgning är visualisering av cell öde i kombination med ett lineage tracing system. Lineage tracing är märkning av en specifik gen/markör i en cell som kan överföras till alla dotter celler och är bevarad över tid15. Som sådan, är det ett kraftfullt verktyg som kan användas för att bestämma ödet för cellens avkomma15. Sedan 1990-talet, Cre-LoxP rekombinant systemet har blivit en kraftfull metod för lineage tracing i levande organismer15. När en mus linje som uttrycker Cre, en DNA recombinase enzym, korsas med en annan mus linje uttrycker en reporter som angränsar till en loxP-STOP-loxP-sekvens, är reporter proteinet uttryckta15.
För hela-mount färgning, är användning av fluorescerande multicolor reportrar lämplig för avbildning av fett eftersom det möjliggör för minimal störning med intracellulära aktiviteter av fettceller16. Dock färga traditionella reportrar vanligtvis cytoplasman, vilket gör det svårt att spåra linjen av vita fettceller, som har begränsad cytoplasmiska innehåll17. För att lösa detta problem, är användning av membran-bundna fluorescerande tdTomato/membran andra (mT/mG) reporter markör ett idealiskt verktyg. Membran-riktade tdTomato uttrycks i Cre-negativa celler18. På Cre excision uppstår en switch för membran-riktade andra uttryck, att göra denna reporter passande för att spåra linjen av fettceller föräldraparets17,18 (Kompletterande figur 1).
Syftet med denna uppsats är att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för hela-mount färgning och visa hur det kan kombineras med andra tekniker för att studera utveckling och fysiologi av fettvävnad. Två exempel på program som beskrivs i detta protokoll är dess användning med 1) multicolor reporter mus linjer att identifiera olika ursprung av adipocyter och 2) vävnad clearing för att ytterligare visualisera den neurala arborization i vit fettvävnad (WAT).
Protocol
Representative Results
Discussion
Även konventionella tekniker såsom histologi och cryosection erbjuda fördelar för observation av intracellulära struktur, ger hela-mount färgning ett annat perspektiv i fettvävnad forskning, vilket möjliggör 3D visualisering av cellular arkitekturen av minimalt bearbetade vävnad.
För att kunna utföra hela-mount färgning, bör följande beaktas. Olika fettvävnad depåer kan ge olika immunfärgning resultat; typ av fettvävnad depot används bör således fastställas först. Brun …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades genom bidrag från de naturliga vetenskaperna och Engineering Research rådet (NSERC) av Kanada, Pilot och Feasibility Study Grant av Banting & bästa Diabetes Centre (BBDC), av SickKids startfonden till H-K. S., medicinsk forskning Center Program (2015R1A5A2009124) genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT, och framtiden planerar att J-R.K.
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
