Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme
Summary
Yağ dokusu mimarisi ve hücresel bileşeni 3D görüntüleme için ideal bir yöntem olarak bütün Dağı immunostaining ve görselleştirme tekniği göstermek için çalışmanın odak noktasıdır.
Abstract
Yağ dokusu yüksek plastisite ile önemli bir metabolik organ ve çevresel uyaranlara ve besin durum duyarlı. Bu nedenle, Morfoloji ve yağ dokusu biyoloji çalışmaya çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Ancak, geleneksel görüntüleme yöntemleri 3D Mimarlık bütün organ yakalamak başarısız doku, 2D bölümlerde eğitim için sınırlıdır. Burada bütün-mount mevcut boyama, en az işlem adımları ile olduğu gibi yağ dokusu morfoloji korur bir immünhistokimya yöntemi. Bu nedenle, adipositler ve diğer hücresel bileşenleri yapılar dokusunun en iyi temsil eden 3 boyutlu görselleştirme elde bozulma korunur. Buna ek olarak, Bütün Dağı boyama hücre kader kararlar belirlemek için soy izleme yöntemleri ile birleştirilebilir. Ancak, bu teknik daha derin bölgelerinde yağ dokusu ile ilgili doğru bilgi sağlayan bazı sınırlamalar vardır. Bu sınırlamayı aşmak için bütün Dağı boyama daha fazla doku doku solukluk kaldırmak ve tüm yağ dokusu anatomi ışık sayfalık floresan mikroskopisi kullanılarak tam görselleştirme için izin vermek için teknikleri temizlenmesi ile kombine edilebilir. Bu nedenle, bir daha yüksek çözünürlük ve yağ dokusu yapıları daha doğru bir şekilde temsil bu tekniklerin birleşimi ile yakalanabilir.
Introduction
Yağ dokusu enerji depolama için önemli bir organdır ve dinamik remodeling ve neredeyse sınırsız genişleme1ile karakterizedir. Enerji homeostazı yanı sıra yağ dokusu da tüm vücut metabolik fonksiyon2modüle için 50’den fazla adipokines hormon salgısı önemli bir rol oynar. Yağ dokusundan oluşan çeşitli mimari olgun adipositler, fibroblastlar, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve adipocyte progenitör hücrelerin3de dahil olmak üzere hücre türleri vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda obezite ve diğer metabolik fonksiyon bozukluğu önemli ölçüde yağ dokusu işlev ve hangi içerir ancak adipositler, iltihabi hücre infiltrasyonu genişleme için sınırlı değildir onun microenvironment değiştirebilirsiniz göstermiştir (Örneğin, makrofajlar) ve vasküler disfonksiyon3.
Histoloji ve cryosectioning gibi geleneksel morfolojik teknikleri gibi doku büzülme ve yapısı bozulma3‘ eyol açabilir uzun kimyasal işleme adımlarını adipose biyoloji okuyan bazı sınırlamaları göstermek, 4. Ayrıca, bu 2D teknikler elde edilen bölümler tüm doku3daha küçük bölgelere sınırlı olarak hücreler arası etkileşimler tarafından farklı hücre tipleri, sarf gözlemlemek yetersizdir. Floresan görüntüleme kıyasla geleneksel yöntemleri, Bütün Dağı boyama katıştırma, kesit ve su kaybı gibi ek invaziv adımları gerektirmez; Böylece, bu antikor özgüllük azalan sorunu önler. Bu nedenle, adipocyte Morfoloji ve genel yağ doku yapısı5daha iyi korunması ile görüntüleme yağ dokusu için basit ve etkili bir yöntem olduğunu. Bu nedenle, bütün bir hızlı ve ucuz immunolabeling Teknik yağ dokusu 3D Mimarlık1,6,7,8korumak için belirlenen boyama monteli.
Ancak, Bütün Dağı boyama kullanımı ile yağ dokusu morfoloji korunması rağmen bu teknik dokusunun lipid yüzeyin altında iç yapıları görselleştirmek hala değiştiremiyor. Birkaç son çalışmalar9,10 yağ dokusu içinde kapsamlı 3D görüntüleme için izin vermek için bütün-mount immunolabeling1,6 ile birlikte teknikleri takas doku kurduk. Özellikle, yoğun nöral ve damarlara ağları son çalışmalar9,10,11,12 ile 3B cilt görüntüleme görüntülenir. Nitekim, Yağ dokusundan farklı fizyolojik koşullar altında sinir ve damar plastisite eğitim onun biyoloji çalışma için gerekli olduğunu. Immunolabeling etkin üç boyutlu görüntüleme solvent temizlenmiş organlar (iDISCO +) doku Temizleme metanol öncesi tedavisi, immunolabeling, oluşan ve organik kimyasal reaktifler diklorometan (DCM ile doku solukluk, takas bir süreçtir ) ve dibenzyl eter (DBE)13,14. Yağ dokusu tamamen saydam yaparak, kan damarları ve sinir lifleri gibi doku içinde anatomi daha doğru bir temsil9,10elde edilebilir. IDISCO + çeşitli antikor ve floresan gazetecilere11,14ile uyumlu ve birden fazla organ ve hatta embryoes14başarı göstermiş olduğu avantajları vardır. Ancak, onun ana sınırlama 18-20 gün tüm deney tamamlamak için gerekli olan bir uzun bir kuluçka zamanı geldi.
Bütün Dağı boyama başka bir önemli hücre kaderi bir soy izleme sistemi ile birlikte görselleştirme bir uygulamadır. Soy izleme tüm kızı hücrelere geçişini sağlamak ve zaman15korunmuş bir hücreye belirli bir gen/işaretleyici etiketleme olduğunu. Bu nedenle, bu bir hücrenin Döl15kaderini belirlemek için kullanılan güçlü bir araçtır. 1990’lardan beri Cre-LoxP rekombinant sistem soy izleme yaşam için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir organizmalar15. Ne zaman bir loxP-STOP-loxP dizisine bitişik bir muhabir ifade başka bir fare çizgi ile Cre, bir DNA recombinase enzim ifade eden fare haddini aştı, ifade15muhabir proteindir.
Bütün Dağı boyama için floresan çok renkli gazetecilere kullanımı adipocyte16hücre içi faaliyetleri ile minimal girişim için izin verdiği için yağ dokusunun görüntüleme için uygundur. Ancak, geleneksel gazeteciler genellikle sitoplazmik içerik17sınırlı beyaz adiposit soyundan izini zorlaştırır sitoplazma, leke. Bu sorunu çözmek için floresan tdTomato membran/membran bağlı eGFP (mT/mG) muhabir işaret kullanımını ideal bir araçtır. TdTomato membran hedefli Cre-negatif hücreleri18‘ ifade edilir. CRE eksizyon membran hedefli eGFP ifade için bir geçiş oluşur, bu muhabir adipocyte ataları17,18 (Ek şekil 1) soy izleme için uygun yapma.
Bütün Dağı boyama için detaylı bir protokol sağlar ve geliştirme ve yağ dokusu fizyolojisi çalışmaya diğer teknikleri ile birleştirilmesi göstermek için bu kağıt amacı budur. İki uygulamalar bu iletişim kuralında tanımlanan kullanımı adiposit ve 2) doku daha fazla beyaz Yağ dokusundan (WAT) sinir arborization görselleştirmek için takas çeşitli kökenleri tanımlamak için 1) çok renkli muhabir fare çizgili örnekleridir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histoloji ve cryosection gibi geleneksel teknikleri hücre içi yapısı gözlemlemek için avantajlar, Bütün Dağı boyama cep 3D görselleştirme sağlar yağ dokusu araştırma farklı bir bakış açısı sağlar minimal işlenmiş doku mimarisi.
Bütün Dağı boyama başarıyla gerçekleştirmek için aşağıdaki önerileri dikkate alınmalıdır. Farklı yağ dokusu depoları çeşitli immunostaining sonuçlar olabilir; Bu nedenle, kullanılan yağ dokusu depo türünü ilk tespit ed…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada, Pilot ve fizibilite çalışması Grant Banting & H-K. SickKids başlangıç Fonu’na en iyi diyabet Merkezi (BBDC) tarafından finanse edildi S., tıbbi araştırma merkezi programı (2015R1A5A2009124) aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama için J-yazar tarafından finanse edilen NMG)
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
