Bewertung des Zusammenspiels zwischen dem Komplementprotein C1q und Hyaluronsäure bei der Förderung der Zelladhäsion
Summary
Die Komplementkomponente C1q ist ein in der Gewebemikroumgebung hochgradig exprimiertes pro-inflammatorisches Molekül, das mit der extrazellulären Matrix interagieren kann. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu testen, wie C1q, das an Hyaluronsäure gebunden ist, die Zellhaftung beeinflusst.
Abstract
Es wurde zunehmend gezeigt, dass die Tumormikroumgebung eine aktive Rolle bei Neoplasiewachstum und Metastasen spielt. Durch verschiedene Wege können Tumorzellen stromale, Immun- und Endothelzellen effizient rekrutieren, indem sie stimulierende Faktoren, Chemokine und Zytokine sezernieren. Im Gegenzug können diese Zellen die Signaleigenschaften der Mikroumgebung verändern, indem sie wachstumsfördernde Signale, Metaboliten und extrazelluläre Matrixkomponenten freisetzen, um eine hohe Proliferation und metastasierende Kompetenz aufrechtzuerhalten. In diesem Zusammenhang identifizieren wir, dass die Komplementkomponente C1q, die lokal durch eine Reihe von menschlichen bösartigen Tumoren stark exprimiert wird, wenn sie mit der extrazellulären Matrix Hyaluronsäure interagiert, das Verhalten von Primärzellen stark beeinflusst, die aus dem menschlichen Tumor isoliert sind. Exemplare. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu testen, wie C1q, das an Hyaluronsäure (HA) gebunden ist, die Adhäsion von Tumorzellen beeinflusst, was der Tatsache zugrunde liegt, dass die biologischen Eigenschaften der Wichtigsten komponenten der extrazellulären Matrix (in diesem Fall HA) durch bioaktive Signale in Richtung Tumor geformt werden können. Fortschreiten.
Introduction
Die Tumormikroumgebung (TME) beeinflusst die Entwicklung und Progression von Krebs, da sie eine freizügige Nische für Zellüberleben, Wachstum und Invasion bieten kann. Die Identifizierung neuer Schlüsselakteure in TME kann für die Entdeckung neuer molekularer Werkzeuge für die Zieltherapie nützlich sein. TME umfasst ein komplexes und dynamisches Netzwerk von nicht-bösartigen Zellen, wie Endothelzellen, Fibroblasten und Zellen des Immunsystems, eingebettet in die umgebenden extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) einschließlich Kollagene, Laminine, Fibronectine, Proteoglykane und Hyaluronane. Sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumorzellen synthetisieren und sezernieren ECM-Komponenten zusammen mit Zytokinen, Chemokinen, Wachstumsfaktoren und entzündlichen und Matrix-Remodeling-Enzymen, die insgesamt die physikalischen, chemischen und signalischen Eigenschaften von TME verändern. Unter diesen Bestandteilen, Hyaluronsäure (HA) hat sich herausgebildet, um eine entscheidende Rolle in der Tumorbiologie zu üben. Trotz seiner einfachen chemischen Zusammensetzung kann HA zusammen mit seinen HA-bindenden Molekülen (Hyaladherinen) Angiogenese, Reaktionsfähigkeit des Immunsystems und ECM-Umbau in einer größen- und konzentrationsabhängigen Weise modulieren1.
Das Komplementsystem (C) ist auch Teil der lokalen TME, die in letzter Zeit zunehmend Beachtung gefunden hat. Das C-System umfasst eine Reihe von löslichen und membrangebundenen Proteinen, die an der ersten Verteidigungslinie gegen Nicht-Selbstzellen, unerwünschte Wirtselemente und Krankheitserreger beteiligt sind. Funktionell verbindet das C die Zweieffekterarme angeborener und adaptiver Systeme, um entweder die direkte Zelltötung oder die Montage einer Entzündungsreaktion zu fördern2. C-Aktivierung kann Tumorwachstum unterdrücken, indem krebsartige Zellen zerstört oder ihr Auswuchs hemmt, aber es ist immer klarer geworden, dass es eine tumorfördernde Aktivität besitzen kann, indem es chronische Entzündungen aufrechterhält und die Etablierung eines immunsuppressives Milieu, die Angiogenese induzieren und krebsbedingte Signalwege aktivieren3. In diesem Zusammenhang hat sich C1q, das erste Erkennungsmolekül des klassischen Signalwegs des C-Systems, herausgebildet, um wichtige Funktionen in der Tumormikroumgebung unabhängig von c-Aktivierung4auszuüben. C1q hat sich gezeigt, lokal durch eine Reihe von menschlichen bösartigen Tumoren ausgedrückt werden, wo es Krebszelladhäsion, Migration und Proliferation zusätzlich zu Angiogenese und Metastasierung5bevorzugen kann. Interessanterweise interagiert C1q mit einem hauptbestandteil des ECM wie HA.
Wir entwickelten eine Technik, um die primären Krebszellen von der Tumormasse zu isolieren. Darüber hinaus haben wir die Matrix entwickelt, die die Tumormikroumgebung stimulieren kann, insbesondere die Wechselwirkung zwischen C1q und hochmolekularer Hyaluronsäure. C1q gebunden an HA war in der Lage, Adhäsion der Tumorzellen zu induzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine einfache Methode, um zu untersuchen, wie die Komplementkomponente C1q, die mit Hyaluronsäure interagiert, in der Lage ist, das Verhalten von Primärzellen zu modulieren, die aus menschlichen Tumorgeweben isoliert sind. Sowohl HA als auch C1q sind sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen reichlich in der Gewebemikroumgebung vorhanden und nehmen an mehreren zellbiologischen Prozessen teil. Zum Beispiel, C1q hat sich gezeigt, in der Mikroumgebung der Plazenta vorhanden zu …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ivan Donati für die Bereitstellung von HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Abteilung für Gynäkologie der IRCCS “Burlo Garofolo”, Triest, Italien) und Andrea Romano (Operative Klinische Abteilung für Anatomie und pathologische Histologie, Cattinara Krankenhaus, Triest, Italien ) für die Gewebeprobenentnahme. Wir danken auch Nicolé Morosini für die Hilfe bei der Videovorbereitung und Alex Coppola, der Stimme. Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Instituts für Mütter- und Kindergesundheit, IRCCS “Burlo Garofolo”, Triest, Italien (RC20/16) und Fondazione Cassa di Risparmio Trieste an R.Bulla unterstützt.
Materials
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
- Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
- Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
- Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
- Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
- Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
- Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
- Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
- Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).
