Evaluering av samspillet mellom komplement protein C1q og hyaluronsyre i fremme Cell vedheft

Summary

Komplement komponenten C1q er en Pro-inflammatorisk molekyl høyt uttrykt i vevet mikromiljøet som kan samhandle med ekstracellulære matrise. Her beskriver vi en metode for å teste hvordan C1q bundet til hyaluronsyre virkninger celle vedheft.

Abstract

Det har blitt stadig demonstrert at tumor mikromiljøet spiller en aktiv rolle i neoplasi vekst og metastasering. Gjennom ulike trasé, kan tumorceller effektivt rekruttere stromal, uimottakelig og endothelial celler ved sekresjon stimulerende faktorer, chemokiner og cytokiner. I sin tur disse cellene kan endre signalering egenskapene til mikromiljøet ved å frigjøre vekst-fremme signaler, metabolitter og ekstracellulære matrise komponenter for å opprettholde høy spredning og metastatisk kompetanse. I denne sammenheng identifiserer vi at komplement komponenten C1q, høyt uttrykt lokalt av en rekke menneskelige ondartede svulster, ved samspill med ekstracellulære matrise hyaluronsyre, sterkt påvirker atferden til primær celler isolert fra menneskelig svulst Prøver. Her beskriver vi en metode for å teste hvordan C1q bundet til hyaluronsyre (HA) virkninger tumor celle vedheft, underliggende det faktum at de biologiske egenskapene til viktige komponenter i ekstracellulære matrise (i dette tilfellet HA) kan formes av bioaktive signaler mot tumor Progresjon.

Introduction

Svulsten mikromiljøet (TME) påvirker kreftutvikling og progresjon siden det kan gi en ettergivende nisje for celle overlevelse, vekst og invasjon. Identifisering av nye sentrale aktører i TME kan være nyttig for oppdagelsen av nye molekylære verktøy for mål behandling. TME inkluderer et komplekst og dynamisk nettverk av ikke-ondartet celler, slik som endothelial celler, fibroblaster og celler av immunsystemet, innebygd i de omkringliggende ekstracellulære Matrix (ECM) komponenter inkludert kollagen, laminins, fibronectins, proteoglycans og hyaluronans. Både tumor og ikke-tumorceller syntetisere og skiller ut ECM komponenter sammen med cytokiner, chemokiner, vekstfaktorer og inflammatorisk og matrise remodeling enzymer som samlet endre fysiske, kjemiske og signalering egenskaper TME. Blant disse bestanddeler, hyaluronsyre (HA) har dukket opp for å utøve en avgjørende rolle i tumor biologi. Til tross for sin enkle kjemiske sammensetning, HA, sammen med sine HA-bindende molekyler (hyaladherins), kan modulere angiogenese, immunsystemet respons og ECM remodeling i en størrelse og konsentrasjon avhengig måte¹.

Komplement (C) systemet er også en del av den lokale TME, som nylig har fått økende oppmerksomhet. C-systemet omfatter et sett av løselige og membran bundne proteiner som er involvert i den første forsvarslinjen mot ikke-selv-celler, uønskede verts elementer og patogener. Funksjonelt, forbinder C de to-effektor armer av medfødte og adaptive systemer for å fremme enten direkte celle drap eller montering av en inflammatorisk respons². C aktivering kan undertrykke tumor vekst, ved å ødelegge kreftceller eller hemme deres utvekst, men det har blitt stadig klarere at det kan ha en svulst-fremme aktivitet ved å opprettholde kronisk betennelse, fremme etablering av en immunsuppressiv miljø, inducing angiogenese, og aktivere kreft-relaterte signalnettverk trasé³. I denne sammenheng C1q, den første anerkjennelse molekyl av den klassiske veien til C-systemet har dukket opp til å utøve viktige funksjoner i svulsten mikromiljøet uavhengig av C-aktivering⁴. C1q har vist seg å være uttrykt lokalt av en rekke menneskelige ondartede svulster, hvor det kan favorisere kreftcelle vedheft, migrasjon og spredning i tillegg til angiogenese og metastasering⁵. Interessant C1q samhandler med en stor bestanddel av ECM som HA.

Vi utviklet en teknikk for å isolere den primære kreftceller fra tumor massen. Videre skapte vi matrisen, som kan stimulere tumor mikromiljøet, spesielt samspillet mellom C1q og høy molekylvekt hyaluronsyre. C1q bundet til HA var i stand til å indusere vedheft av tumorceller.

Protocol

Vevsprøver fra pasienter ble innhentet etter informert samtykke etter godkjennelse av de etiske betraktninger fra det institusjonelle styret ved Universitetssykehuset i Trieste i Italia. 1. tumor celle isolasjon og kultur (dag 1) Isoler humant Mesothelioma celler fra MPM solide prøver. Fint hakke vevet med en kutter for å få fragmenter av ca 2-3 mm2 i størrelse og ruge i 5 ml fordøyelsen løsning bestående av Hanks ‘ balansert salt Solution (HBSS) supplert med 0,5 m…

Representative Results

HA er en negativt ladet høy molekylvekt polysakkarid, som består av repeterende (β, 1-4)-D-glucuronic acid-(β, 1-3)-N-acetyl-D-Glucosamine disakkarid Units (figur 1B)7. Forekomsten av bindingen av HA på 96-brønn plate samt effektiviteten av sine immobilisering ble testet dra nytte av biotinylated HA (bio-HA). Ulike konsentrasjoner av bio-HA, fra 10 μg/mL til 1 mg/mL, ble re-suspendert i 100 mM/bikarbonat-buffer pH 9,6 og inkuber…

Discussion

Vi beskriver en enkel metode for å undersøke hvordan komplement komponenten C1q, i samspill med hyaluronsyre, er i stand til å modulere atferden til primære celler isolert fra menneskelig tumor vev. Både HA og C1q er rikelig tilstede i vevet mikromiljøet både under fysiologiske og patologiske tilstander, som deltar i flere celle biologiske prosesser. For eksempel har C1q vist seg å være til stede i mikromiljøet av morkaken der det favoriserer extravillous trophoblast invasjon av mors Vertsplanter under placenta…

Materials

100 µm pore filter	BD Falcon	352360
Amphotericin B solution (fungizone)	Sigma-Aldrich	1397-89-3
basic FGF	Immunological Sciences	GRF-15595
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C-4901
Collagenase type I	Worthington Biochemical Corporation, DBA	MX1D12644
D-Glucose	Sigma-Aldrich	50-99-7
DNase I	Roche	10 104 159 001
EDTA	Sigma-Aldrich	60-00-4
EGF	Immunological Sciences	GRF-10544
FAST DiI	Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	D7756
Fetal bovine serum	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	10270-106
Fibronectin	Roche	11051407001
Flask for cell culture	Corning	430639	Sterile, vented
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397-10ML
Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS)	Sigma-Aldrich	H6648	Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone
High molecular weight hyaluronic acid	Kind gift by Prof. Ivan Donati
Human endothelial serum free medium	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	11111-044	Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and  1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich)
Magnesium Chloride	Carlo Erba	13446-18-9
Medium 199 with Hank’s salt	Sigma-Aldrich	M7653
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Time-lapse microscopy	Nikon	Imaging System BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader	Flow Labs
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4674