Utilisation complémentaire des techniques microscopiques et de la lecture de fluorescence dans l'étude des interactions Cryptococcus-Amoeba
Summary
Cet article détaille un protocole pour la préparation d’une co-culture de cellules cryptococciques et d’amibes qui est étudiée à l’aide d’images fixes fluorescentes et d’images de microscope électronique à transmission haute résolution. Illustré ici est comment les données quantitatives peuvent compléter ces informations qualitatives.
Abstract
Pour simuler l’infection à Cryptococcus, l’amibe, qui est le prédateur naturel des cellules cryptococciques dans l’environnement, peut être utilisée comme modèle pour les macrophages. Cet organisme prédateur, semblable aux macrophages, utilise la phagocytose pour tuer les cellules intériorisées. À l’aide d’un microscope à balayage laser confocal, des images illustrant des moments interactifs entre les cellules cryptococciques et les amibes sont capturées. La puissance de résolution du microscope électronique aide également à révéler le détail ultrastructural des cellules cryptococciques lorsqu’ils sont piégés à l’intérieur de la vacuole alimentaire amibe. Comme la phagocytose est un processus continu, les données quantitatives sont ensuite intégrées dans l’analyse pour expliquer ce qui se passe au moment où une image est capturée. Pour être précis, des unités de fluorescence relative sont lues afin de quantifier l’efficacité de l’amibe dans l’intériorisation des cellules cryptococciques. À cette fin, les cellules cryptococciques sont tachées d’un colorant qui les rend fluoresce une fois piégés à l’intérieur de l’environnement acide de la vacuole alimentaire. Lorsqu’elles sont utilisées ensemble, l’information recueillie grâce à de telles techniques peut fournir des informations critiques pour aider à tirer des conclusions sur le comportement et le sort des cellules lorsqu’elles sont intériorisées par l’amibe et, éventuellement, par d’autres cellules phagocytiques.
Introduction
Les microbes ont évolué au fil du temps pour occuper et prospérer dans différentes niches écologiques telles que les limites physiques ouvertes du sol et de l’eau, entre autres1. Dans ces niches, les microbes se livrent souvent à la concurrence directe pour des ressources limitées; important, pour les nutriments qu’ils utilisent pour soutenir leur croissance ou l’espace, dont ils ont besoin pour accueillir la population en expansion2,3. Dans certains cas, certains organismes holozoïques comme l’amibe peuvent même être antérieurs sur les cellules cryptococciques comme un moyen d’extraire les nutriments de leur biomasse4,5. À son tour, cela permet à ces organismes d’établir une domination territoriale en contrôlant le nombre de populations de ses proies. En raison de cette pression prédatrice, certaines proies peuvent être sélectionnées pour produire des facteurs microbiens, comme la capsule cryptococcique6, pour concilier les effets négatifs de la pression. Cependant, comme conséquence involontaire de cette pression, certains microbes acquièrent des facteurs qui leur permettent de franchir la barrière des espèces et de chercher de nouvelles niches pour coloniser7, comme les espaces confinés du corps humain qui sont riches en nutriments et ont idéal Conditions. Ce dernier peut expliquer comment un microbe terrestre comme Cryptococcus (C.) neoformans peut se transformer pour devenir pathogène.
À cette fin, il est important d’étudier le contact initial que les cellules cryptococciques peuvent avoir avec l’amibe et comment cela peut les sélectionner pour devenir pathogènes. Plus précisément, cela peut donner des indices sur la façon dont les cellules cryptococciques se comportent lorsqu’elles sont traitées par des macrophages pendant l’infection. C’est pour cette raison que l’amibe a été choisie comme modèle pour les macrophages ici, car il est relativement bon marché et facile de maintenir une culture de l’amibe dans un laboratoire8. D’intérêt était également d’examiner comment les métabolites secondaires cryptococcal viz. 3-hydroxy acides gras9,10 influencent l’interaction entre les amibes et les cellules cryptococciques.
Une façon simple de percevoir l’interaction entre l’amibe et sa proie à l’œil nu est de créer une pelouse en utilisant sa proie à la surface d’une plaque d’agar et repérer l’amibe. La visualisation des plaques ou des zones claires sur la plaque d’agar représente des zones où l’amibe peut s’être nourrie de sa proie. Cependant, à ce niveau macro, seul le résultat du processus est noté, et le processus de phagocytose est mécanisé ne peut pas être observé. Par conséquent, pour apprécier le processus sur une base de cellule à cellule, il existe plusieurs méthodes microscopiques qui peuvent être utilisés11,12. Par exemple, un microscope inversé avec une chambre d’incubation peut être utilisé pour enregistrer un time-lapse d’événements entre une cellule phagocytique et sa cible13. Malheureusement, en raison du coût d’un microscope avec une fonctionnalité time-lapse, il n’est pas toujours possible pour les laboratoires d’acheter un tel microscope, en particulier dans les ressources pauvres en milieux.
Pour contourner la limitation ci-dessus, cette étude présente une conception exploratoire séquentielle qui évalue l’interaction de C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 et C. neoformans LMPE 046 avec Acanthamoeba castellani . Tout d’abord, une méthode qualitative est utilisée qui précède une méthode quantitative. Des images fixes sont capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée, ainsi que d’un microscope électronique de transmission pour représenter les interactionsamibe-Cryptococcus. Ceci a été suivi par quantifier la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaque pour estimer l’efficacité de l’amibe pour internaliser les cellules cryptococciques. En conciliant des résultats de ces méthodes pendant l’étape de données-interprétation, ceci peut également indiquer autant d’information critique que parcourant une vidéo de time-lapse de phagocytosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans l’article, différentes techniques ont été utilisées avec succès pour révéler les résultats possibles qui peuvent survenir lorsque l’amibe interagir avec les cellules cryptococciques. En outre, nous avons été intéressés à montrer les effets des acides gras 3-hydroxy sur les résultats des interactions Cryptococcus-amoeba.
La première technique utilisée était la microscopie confocale, qui rendait des images fixes. Le principal inconvénient de cette technique ici ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu par une subvention de la National Research Foundation of South Africa (numéro de subvention: UID 87903) et de l’Université de l’État libre. Nous sommes également reconnaissants des services et de l’assistance offerts par Pieter van Wyk et Hanlie Grobler lors de nos études de microscopie.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
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