مقايسة نقل رودوبسين بتحليل التصوير عالية-المحتوى
Summary
هنا، يمكننا وصف أسلوب تصوير عالية المحتوى التحديد الكمي لنقل طفرات رودوبسين المرتبطة بالتهاب الشبكية الصباغي. تحليل سجل متعددة-الطول الموجي استخدمت لتحديد كمية البروتين رودوبسين على سطح الخلية أو في الخلية كلها.
Abstract
رودوبسين misfolding الطفرات تؤدي إلى وفاة مستقبله رود أن يتجلى جسمية مهيمنة التهاب الشبكية الصباغي (RP)، متدرجة المسببة للعمى المرض الذي يفتقر إلى العلاج الفعال. نحن افترض أن سيتوتوكسيسيتي متحولة رودوبسين تجمعات يمكن تخفيفها باستقرار عقاقيري البروتين رودوبسين المسخ. الطفرة P23H، بين الطفرات رودوبسين “الثاني فئة” أخرى، يشفر بروتين متحولة رودوبسين هيكلياً غير مستقرة التي تراكمت في هيولى (ER)، بينما رودوبسين نوع البرية تنقل إلى غشاء البلازما في الثدييات الخلايا. نحن سابقا أداء شاشة الفائق على أساس التﻷلؤ (HTS)، وحددت مجموعة من مرافقين الدوائية التي أنقذت بنقل رودوبسين P23H من ER لغشاء البلازما. هنا، باستخدام أسلوب immunostaining متبوعة بتحليل تصوير عالية المحتوى، نحن كمياً مقدار البروتين رودوبسين المسخ في الخلية كلها وفي غشاء البلازما. هذه الطريقة مفيدة وفعالة لتحديد الزيارات الحقيقية من إيجابيات كاذبة عقب HTS. بالإضافة إلى ذلك، تحليل صورة عالية–محتوى مكنتنا من تحديد معلمات متعددة من تجربة واحدة لتقييم الخصائص الدوائية لكل مجمع. باستخدام هذا الفحص، قمنا بتحليل تأثير مركبات مختلفة 11 نحو ستة طفرات رودوبسين RP المرتبطة، الحصول على ملف تعريف دوائية 2-د لفهم الكمية والنوعية عن الاستقرار الهيكلي لهذه المسوخ رودوبسين وفعالية مركبات مختلفة تجاه هذه المسوخ.
Introduction
ويشارك misfolding البروتين في ضمور العضلات، تنكسات العصبية، فضلا عن الأمراض المسببة للعمى، بما في ذلك التهاب الشبكية الصباغي (RP)1. RP تنكس شبكية الموروثة والتدريجي المرتبطة بطفرات في ما يزيد على 60 من الجينات التي تؤثر على وظيفة والتوازن photoreceptors رود أو2،ابيثيليومس المصطبغة الشبكية (الرؤى)3. لا يوجد علاج فعال متوفر حاليا للبرنامج العادي. رودوبسين الطفرات تستأثر بحوالي 25-30% من جسمي المهيمنة (ad) الحالات RP. من بين أكثر من 150 رودوبسين الطفرات4 (الجينات البشرية الطفرة قاعدة، http:/www.hgmd.cf.ac.uk/)، تسبب طفرات “الفئة الثانية” عدم الاستقرار الهيكلي من البروتين رودوبسين يسهم في وفاة مستقبله رود و رؤية فقدان5،6،،من78. P23H هو طفرة رودوبسين الأكثر شيوعاً في أمريكا الشمالية، وأيضا مثال نموذجي “الفئة الثانية” رودوبسين الطفرات9،10. سبب في عدم الاستقرار الهيكلي الكامن، تراكمت رودوبسين تجمعات في هيولى (ER) في خلايا الثدييات، بينما يقع رودوبسين نوع البرية على غشاء البلازما5. رودوبسين تجمعات P23H المعارض متحولة المهيمنة سيتوتوكسيسيتي السلبية التي ليس بسبب هابلوينسوفيسينسي، ولكنه يرتبط بتنشيط ER المرتبطة مسار تدهور البروتين وتنظيم الجزء الخارجي قضبان تمت مقاطعتها. للتخفيف من حدة الإجهاد خلية مستقبله رود، استراتيجية واحدة لتحقيق استقرار الطي أصلي من رهودوبسن متحولة كوصي دوائية باستخدام.
ولتحقيق هذا الهدف، أجرينا12،11،شاشة الفائق المستندة إلى الخلية (هتس)13 استخدام مقايسة تكامل يفتت β-جالاكتوسيداسي للتحديد الكمي للمسخ رودوبسين P23H تنقل على البلازما غشاء. البروتوكول بسيطة وقوية لهذا الإنزيم HTS مكنتنا من استكشاف أنشطة حوالي 79,000 الجزيئات الصغيرة لكل شاشة. ومع ذلك، نظراً لأن هذا الإنزيم HTS يقرأ إشارات التﻷلؤ، المغلوطة بما في ذلك مثبطات بيتا-غال، المركبات الملونة أو السامة للخلايا مدرجة في قائمة انتظار التي تحددها تحليل ثانوي.
إيمونوستينينج التقليدية وأساليب التصوير fluorescence استخدمت لسنوات لدراسة النقل رودوبسين في خلايا الثدييات5،14،،من1516. ومع ذلك، لا يمكن استخدام هذه الأساليب التقليدية لقياس التأثيرات الدوائية أكثر من 10 مركبات نحو النقل رودوبسين لأنه يتطلب إجراء تحليل تصوير موثوق بها عدد كبير من الصور التي اتخذت تحت شرط متسقة عالية، لا تنظيمي بأساليب التصوير التقليدية. هنا، وضعنا بروتوكولا تصوير إيمونوستينينج على أساس محتوى عالية كتحليل ثانوي التحديد الكمي للنقل البري والبحري في خلية رودوبسين تجمعات طفرات11،،من1317. لتسمية رودوبسين في غشاء البلازما، علينا تخطي الخطوة permeabilization غشاء الخلايا وإيمونوستاينيد طفرات رودوبسين من رهودوبسن المضادة (B6-30) [مونوكلونل] الاعتراف حانمه الطرفي ن من رهودوبسن في الجانب خارج الخلية للخلية غشاء18. تصور رودوبسين المسخ في الخلية كلها، نحن تنصهر رودوبسين مع البروتين fluorescence فينوس. بالتحديد الكمي كثافات الأسفار في الأسفار مختلف القنوات، نحن قادرون على الحصول على معلمات متعددة من تجربة واحدة واحدة، بما في ذلك كثافة رودوبسين المجموع في الخلية كلها، على سطح الخلية، ونسبة رودوبسين الأسفار على سطح الخلية لأن في كل خلية. تطبيق هذا الأسلوب باستقرار الخلايا معربا عن ما مجموعة ستة تجمعات رودوبسين طفرات، أننا يمكن أن تولد لمحة دوائية لمرافقين جزيء صغيرة متعددة تجاه هذه المسوخ. في هذا البروتوكول، كافة الخلايا إيمونوستينيد في صفيحة 384-جيدا وتصويرها باستخدام نظام تصوير تحت شرط تصوير عالية متسقة. يتم إجراء تحليل صورة لكل بئر، التي تحتوي على صور لأكثر من 600 من الخلايا لتقليل التباين بسبب عدم تجانس الخلايا مع تفاوت مستوى التعبير الشكل والبروتين في الخلية. ويرد في الشكل 1سير العمل لهذا البروتوكول. وميزة هذا الأسلوب أن نحصل على صور عالية الدقة، فضلا عن كوانتيفيكيشنز معلمة متعددة من التحليل القائم على الصورة. بشكل عام، يمكن تعديل هذا البروتوكول وتطبيق على التحديد الكمي لنقل أي بروتين غشائي تجمعات للفائدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، واظهرنا مقايسة تصوير عالية المحتوى المستخدمة لوصف عدد الزيارات المحددة من HTS. أتمتة فقط المشاركة في هذه البروتوكولات هو تصوير عالية-المحتوى. استخدمت إيمونوستاينينج وتصوير الأسفار من رهودوبسن في عادة لوصف توطين رودوبسين5،14،،من15</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر الدكتور مارك شورداك هاء، واكتشاف المخدرات جامعة بيتسبرغ معهد توفير تصوير محتوى عالية والتدريبات الأولية. سخاء يشارك الدكتور كريستوف بالكزيوسكي (حالة جامعة Western Reserve) 4 1 و B630 رودوبسين المضادة الأجسام المضادة. وشاطره بلازميد يحتوي على كدنا من الماوس رودوبسين-فينوس بناء الدكتور نيفين لامبرت (أوغوستا جامعة). وأيد هذا العمل المعهد الوطني للصحة منحة EY024992 للبطاقة الصفراء و P30EY008098 من منحة جامعة بيتسبرغ الرؤية الأساسية للبحث.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochimie. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
