En Rhodopsin Transport Assay af High-indhold Imaging analyse
Summary
Her, beskrevet vi en høj-indhold billedbehandling metode for at kvantificere transport af rhodopsin mutanter tilknyttet retinitis pigmentosa. En multiple-bølgelængde scoring analyse blev brugt til at kvantificere rhodopsin protein på cellens overflade eller i hele cellen.
Abstract
Rhodopsin proteinmisfoldning mutationer fører til stang fotoreceptor død, der manifesterer sig som autosomal dominerende retinitis pigmentosa (RP), progressiv blændende sygdom, der mangler effektive behandling. Vi hypotesen, at cytotoksicitet fejlfoldede rhodopsin mutant kan afhjælpes ved at farmakologisk stabilisere mutant rhodopsin protein. P23H mutationen blandt de andre klasse II rhodopsin mutationer, koder et strukturelt ustabile rhodopsin mutant protein, der er akkumuleret i det endoplasmatiske reticulum (ER), hvorimod vildtype rhodopsin er transporteret til plasmamembran i pattedyr celler. Vi tidligere udført en luminescence-baserede høj overførselshastighed skærm (HTS) og identificeret en gruppe af farmakologiske chaperoner, der reddede transport af P23H rhodopsin fra ER at plasmamembran. Her, kvantificeret ved hjælp af en immunfarvning metode efterfulgt af en høj-indhold imaging analyse, vi mutant rhodopsin protein beløb i hele cellen og på plasmamembran. Denne metode er informativ og effektiv til at identificere sande hits fra falske positiver efter HTS. Derudover gjort high-indhold billedanalyse det muligt at kvantificere flere parametre fra en enkelt eksperiment at evaluere de farmakologiske egenskaber af hver sammensatte. Ved hjælp af denne analyse, analyseret vi virkningen af 11 forskellige forbindelser mod seks RP forbundet rhodopsin mutanter, at opnå en 2D-farmakologisk profil for en kvantitativ og kvalitativ forståelse om den strukturelle stabilitet af disse rhodopsin mutanter og effekten af forskellige forbindelser mod disse mutanter.
Introduction
Protein misfoldning er involveret i Muskelsvindfonden, neurale degenerations og blændende sygdomme, herunder retinitis pigmentosa (RP)1. RP er en arvelig og progressiv retinal degeneration forbundet med mutationer i over 60 gener påvirker funktion og homøostase stang fotoreceptorer eller retinale pigmenteret epitheliums (RPEs)2,3. Ingen effektiv behandling er i øjeblikket tilgængelig for RP. Rhodopsin mutationer tegner sig for omkring 25-30% af autosomal dominerende (ad) RP tilfælde. Blandt de mere end 150 rhodopsin mutationer4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), klasse II mutationer forårsager den strukturelle ustabilitet af rhodopsin protein, der bidrager til stang fotoreceptor død og vision tab5,6,7,8. P23H er den hyppigste rhodopsin mutation i Nordamerika, som også er et typisk eksempel på klasse II rhodopsin mutationer9,10. På grund af dens iboende strukturelle ustabilitet, er den fejlfoldede rhodopsin akkumuleret i det endoplasmatiske reticulum (ER) i pattedyrceller, hvorimod vildtype rhodopsin ligger på plasma membran5. Den fejlfoldede rhodopsin P23H mutant udstiller dominerende negativ cytotoksicitet, der er ikke på grund af haploinsufficiency, men er relateret til aktivering af ER forbundet protein Nedbrydningsvejen og afbrudte stang ydre segment organisation. For at afhjælpe stang fotoreceptor cell stress, er én strategi at stabilisere de indfødte foldning af mutant rhodopsin ved hjælp af en farmakologisk anstandsdame.
For at nå dette mål, udførte vi en celle-baserede høj overførselshastighed skærm (HTSs)11,12,13 ved hjælp af en β-galactosidase fragment komplementering assay for at kvantificere P23H rhodopsin mutant transporteres på plasma membran. Robust og enkel protokol af denne HTS assay aktiveret os til at udforske aktiviteterne i cirka 79.000 små molekyler til hver skærm. Men fordi denne HTS assay læser luminescence signaler, falske positiver herunder β-gal-hæmmere, farvet eller cytotoksiske stoffer indgår i hitlisten venter på at være identificeret ved en sekundær analyse.
Traditionelle immunfarvning og fluorescens Billeddannende metoder har været brugt i årevis til at studere rhodopsin transport i pattedyrceller5,14,15,16. Men disse konventionelle metoder ikke kan bruges til at kvantificere farmakologiske virkninger af mere end 10 forbindelser mod rhodopsin transport, fordi en pålidelig imaging analyse kræver et stort antal af billeder taget under en meget konsekvent betingelse, som er ikke ændres ved de konventionelle Billeddannende metoder. Her, udviklede vi en immunfarvning baseret high-indhold imaging protokol som en sekundær analyse at kvantificere celle overfladetransport fejlfoldede rhodopsin mutanter11,13,17. Hvis du vil navngive rhodopsin på plasma membran, sprunget vi trin i cellemembranen permeabilization og immunostained rhodopsin mutanter af et monoklonalt (B6-30) anti-rhodopsin anerkende den N-terminale epitop af rhodopsin på den ekstracellulære side af cellen membran18. For at visualisere den mutante rhodopsin i hele cellen, smeltet vi rhodopsin med Venus fluorescens protein. Ved kvantificeringen af fluorescens intensiteter i forskellige fluorescens kanaler er vi i stand til at opnå flere parametre fra én enkelt eksperiment herunder samlede rhodopsin intensitet i hele cellen på celleoverfladen, og forholdet mellem rhodopsin fluorescens på cellens overflade, i hele cellen. Anvender denne metode til stabil celler, der udtrykker en i alt seks fejlfoldede rhodopsin mutanter, kan vi generere en farmakologisk profil af flere små molekyle chaperoner mod disse mutanter. I denne protokol, alle celler er immunostained i en 384-godt plade og afbildet ved hjælp af en automatiseret billedbehandling system under en meget konsekvent tænkelig tilstand. En billedanalyse er udført til hver brønd, der indeholder billeder af mere end 600 celler til at reducere variation på grund af heterogenitet af celler med varierende celle form og protein udtryk niveau. Arbejdsprocessen i denne protokol er sammenfattet i figur 1. Fordelen ved denne metode er, at vi får billeder med høj opløsning samt multi-parameter kvantificeringer fra image-baserede analyse. Generelt kan denne protokol ændres og anvendes til at kvantificere transport af enhver fejlfoldede membran protein af interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, viste vi en høj-indhold imaging assay bruges til kendetegner hits identificeret fra en HTS. Den eneste automation involveret i disse protokoller er høj-indhold imager. Immunfarvning og fluorescens billeddannelse af rhodopsin har været anvendt almindeligvis at karakterisere lokalisering af rhodopsin5,14,15,16. Kvantificering af billeder taget af de traditionelle Billeddannende metoder er…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Mark E. Schurdak og University of Pittsburgh Drug Discovery Institut for at levere høj-indhold imager og indledende kurser. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) delt generøst 1 d 4 og B630 anti-rhodopsin antistoffer. Plasmid indeholder cDNA af musen rhodopsin-Venus konstruere deltes af Dr. Nevin Lambert (Augusta Universitet). Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for sundhed grant EY024992 til YC og P30EY008098 fra University of Pittsburgh Vision forskning Core grant.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochimie. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
