高コンテンツ イメージング解析によるロドプシン輸送アッセイ
Summary
ここでは、網膜色素変性症に関連付けられているロドプシン変異体の輸送を定量化する高コンテンツ イメージング法について述べる。多波長得点分析は、タンパク質ロドプシン細胞表面に、または全体のセルを定量化に使用されました。
Abstract
ロドプシンもって変異は常染色体優性支配的な網膜色素変性症 (RP)、まばゆいばかりの効果的な治療法がない疾患進行として明示されるロッド視細胞死に します。我々 は誤って折りたたまれたロドプシン変異体の細胞毒性が薬理学的変異型ロドプシン蛋白を安定化により軽減できることを仮定します。他のクラス II ロドプシン遺伝子の変異の中で、P23H の突然変異は野生型ロドプシン、哺乳類の細胞膜に輸送されるに対し小胞体 (ER) の蓄積は構造的に不安定なロドプシンの変異体タンパク質をエンコードします。セルです。以前発光による高スループット画面 (HTS) を行い細胞膜と小胞体から P23H ロドプシンのトランスポートを救出した薬理学的シャペロンのグループを識別します。ここでは、高コンテンツ イメージング解析に続いて免疫染色法を使用すると、セル全体で膜上の変異型ロドプシン蛋白の量を数値化。この方法は有益であり誤次の HTS. から真のヒット数を識別するために効果的ですさらに、高コンテンツ画像解析では、各化合物の薬理学的特性評価のための単一の実験から複数のパラメーターを数値化することができました。6 関連する RP ロドプシン変異体、これらロドプシン変異体の構造安定性に関する定量的および定性的な理解のための 2 D の薬理学的プロファイルを取得に向けて 11 さまざまな化合物の効果を行ったこの試金を使用して、これらの変異体に向けてさまざまな化合物の有効性と。
Introduction
タンパクは、筋ジストロフィー、神経変性、網膜色素変性症 (RP)1を含む、まばゆいばかりの病気に関与しています。RP は継承と進歩的な網膜変性と機能とロッド視細胞や網膜色素 epitheliums (RPEs)2,3の恒常性に影響を与える 60 以上の遺伝子の突然変異に関連付けられているです。RP には現在効果的な治療法はありません。ロドプシンの突然変異は、RP の場合優性 (ad) の約 25-30% を占めています。クラス II 変異以上 150ロドプシン変異4 (ひと遺伝子変異データベース、http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/) 中、ロッド視細胞死に貢献するロドプシン蛋白構造不安定になるとビジョンの損失5,6,7,8。P23H は北アメリカの最も頻繁なロドプシンの突然変異もクラス II ロドプシン変異9,10の典型的な例であります。その固有の構造不安定性野生型ロドプシン細胞膜5にあるに対し、誤って折りたたまれたロドプシンは哺乳類細胞の小胞体 (ER) に蓄積されます。誤って折りたたまれたロドプシン P23H 突然変異体展示支配的否定的な細胞毒性ハプロ不全により、原因ではないが、小胞体の活性化に関連しては、タンパク質分解経路と中断された棒外側セグメント組織に関連付けられます。棒の光受容器細胞ストレスを軽減するために 1 つの戦略は、薬理学的シャペロンを用いた変異型ロドプシンの折りたたみでネイティブを安定させるためにです。
この目標を達成するために行ったプラズマ輸送 P23H ロドプシンの突然変異体を定量化する β-ガラクトシダーゼ フラグメント否定回路試金を使用して細胞を用いた高スループット画面 (HTSs)11,12,13膜。この HTS アッセイの堅牢でシンプルなプロトコルでは、各画面の約 79,000 小分子の活動を探索することができました。しかし、この HTS アッセイは、発光信号を読み取っているので偽陽性 β gal 阻害剤を含む色または細胞毒性化合物に含まれますセカンダリ分析によって識別される待っているヒット リスト。
伝統的な染色と蛍光イメージング法は、哺乳類細胞5,14,,1516におけるロドプシン輸送を研究に長年使用されています。ただし、信頼性の高い画像解析が必要である非常に一貫した条件の下で撮影した画像の数が多いために、ロドプシン輸送に向けて 10 以上の化合物の薬理学的効果を定量化するこれらの従来の方法は使用できません。従来の撮像方法で不適法。ここでは、我々 は誤って折りたたまれたロドプシン変異体11,13,17のセル表面輸送を定量化する二次試験として免疫染色による高コンテンツ イメージング プロトコルを開発しました。ロドプシン細胞膜上にラベルを付ける、我々 手順をスキップした細胞膜透過と immunostained のロドプシン変異体細胞の細胞外の側でロドプシンの N 末端エピトープを認識モノクローナル抗体 (B6 30) 反ロドプシン膜18。全細胞で変異型ロドプシンを視覚化するには、金星蛍光タンパク質ロドプシンを融合しました。異なる蛍光管内の蛍光強度の定量化、我々 は細胞表面との比、セル全体で合計ロドプシン強度を含む 1 つの単一の実験から複数のパラメーターを取得することができます。ロドプシン セル全体を細胞表面に蛍光します。この方式では、合計六つの誤って折りたたまれたロドプシンの変異体を発現する細胞を安定した、これらの突然変異体の方の複数の小さい分子シャペロンの薬理学的プロファイルを生成できます。このプロトコルではすべて細胞は 384 ウェル プレートで immunostained、非常に一貫した撮像条件下で自動イメージング システムを使用してイメージを作成します。セル形状とタンパク質発現レベルの変動と細胞の不均一性による変動を低減し、600 以上細胞の画像を含む、各ウェルの画像解析が実行されます。このプロトコルのワークフローは、図 1のとおりです。このメソッドの利点は、画像ベースの分析からマルチパラ メーターの数量だけでなく、高解像度画像を得る我々 ことです。一般に、このプロトコルを変更および興味のすべての誤って折りたたまれた膜蛋白質の輸送の定量化に適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ヒット、HTS. から識別の特性評価に使用される高いコンテンツ イメージング アッセイを示したこれらのプロトコルに関連する唯一のオートメーションは高固体撮像素子です。染色とロドプシンの蛍光イメージングは、ロドプシン5,14,15,16のローカリゼーションを特徴付けるために一般?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は博士マーク E. Schurdak に感謝し、ピッツバーグ大学創高コンテンツ イメージャと初期研修を提供する研究所します。博士クシシュトフ ・ Palczewski (ケース ウェスタン リザーブ大学) は寛大 B630 反ロドプシン抗体と 1 4 を共有しました。マウス ロドプシン-金星コンストラクトの cDNA を含んでいるプラスミッド博士ネビン ・ ランバート (オーガスタ大学) で共有されていました。この仕事は、健康からの助成金 EY024992 YC と P30EY008098 にピッツバーグ大学ビジョン研究コア付与の国立研究所によって支えられました。
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochimie. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
