En Rhodopsin Transport analysen av høyt innhold Imaging analyse
Summary
Her beskrev vi en høyt innhold bildebehandling metode for å kvantifisere transport av rhodopsin mutanter tilknyttet retinitis pigmentosa. En flere-bølgelengde scoring analyse ble brukt om å kvantifisere rhodopsin protein på cellens overflate eller i hele cellen.
Abstract
Rhodopsin misfolding mutasjoner føre til rod photoreceptor død som er manifestert som autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), en progressiv blendende sykdom som mangler effektiv behandling. Vi hypothesize at cytotoksisitet av misfolded rhodopsin muterte kan lindres ved farmakologisk stabilisere mutant rhodopsin protein. P23H mutasjon, blant andre klasse II rhodopsin mutasjoner, koder et strukturelt ustabil rhodopsin mutant protein som er akkumuleres i det endoplasmatiske retikulum (ER), mens det vill type rhodopsin transporteres til plasma membranen i pattedyr celler. Vi har tidligere utført en luminescence-baserte høy gjennomstrømming skjerm (HTS) og identifisert en gruppe farmakologiske chaperones som reddet transport av P23H rhodopsin fra ER til plasma membranen. Her kvantifisert bruker en immunostai-metoden etterfulgt av et høyt innhold tenkelig analyse, vi mutant rhodopsin protein mengden i hele cellen og på plasma membranen. Denne metoden er informativ og effektiv å identifisere ekte treff fra falske positiver etter HTS. I tillegg mulig høyt innhold bildeanalyser for oss å kvantifisere flere parametere fra ett enkelt eksperiment å evaluere Farmakologiske egenskaper for hver sammensatte. Bruker denne analysen, analyserte vi effekten av 11 forskjellige forbindelser mot seks RP forbundet rhodopsin mutanter, skaffe en 2D-farmakologiske profil for en kvantitative og kvalitative forståelse for strukturelle stabiliteten av disse rhodopsin mutanter og effekten av ulike forbindelser mot disse mutanter.
Introduction
Protein misfolding er involvert i muskeldystrofi, neural degenerations, samt blendende sykdommer, inkludert retinitis pigmentosa (RP)1. RP er en arvelig og progressive retinal degenerasjon tilknyttet mutasjoner i over 60 gener påvirker funksjon og homeostase av rod fotoreseptorer eller retinal pigmentert epitheliums (RPEs)2,3. Ingen effektiv behandling er tilgjengelig for RP. Rhodopsin mutasjoner utgjør ca 25-30% av autosomal dominant (ad) RP tilfeller. Blant de mer enn 150 rhodopsin mutasjoner4 (menneskelige gen mutasjon Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), klasse II mutasjoner forårsake strukturell ustabilitet av rhodopsin protein som bidrar til at rod photoreceptor og visjonen tap5,6,7,8. P23H er de hyppigste rhodopsin mutasjonen i Nord-Amerika som er også et typisk eksempel på klasse II rhodopsin mutasjoner9,10. På grunn av dens iboende strukturelle ustabilitet, er misfolded rhodopsin akkumuleres i det endoplasmatiske retikulum (ER) i pattedyrceller, mens det vill type rhodopsin ligger på plasma membranen5. Den misfolded rhodopsin P23H mutant utstillinger dominerende negative cytotoksisitet som er ikke på grunn av haploinsufficiency, men er knyttet til aktivering av ER tilknyttet protein fornedrelse veien og avbrutt stang ytre segmentet organisasjonen. For å lindre rod photoreceptor celle stress, er en strategi å stabilisere innfødt folding av den muterte rhodopsin bruker en farmakologisk Anstandsdame.
For å oppnå dette målet, utført vi et cellebasert høy gjennomstrømming skjermen (HTSs)11,12,13 med en β-galactosidase fragment complementation analysen for å kvantifisere P23H rhodopsin mutant transporteres på plasma membran. Robust og enkel protokoll for denne HTS analysen mulig for oss å utforske aktiviteter om 79,000 små molekyler for hver skjerm. Men fordi denne HTS analysen leser luminescence signaler, er falske positiver inkludert β-gal-hemmere, farget eller cytotoksiske forbindelser inkludert i trefflisten venter identifiseres av en sekundær analysen.
Den tradisjonelle immunostai- og fluorescens tenkelig metoder har blitt brukt i år for å studere rhodopsin transport i pattedyrceller5,14,15,16. Men kan disse konvensjonelle metoder brukes å kvantifisere farmakologiske effekter av mer enn 10 forbindelser mot rhodopsin transport fordi en pålitelig tenkelig analyse krever et stort antall bilder tatt under en svært konsekvent tilstand, som er ikke amendable av konvensjonelle tenkelig metoder. Her har vi utviklet en immunostai-basert høyt innhold tenkelig protokoll som en sekundære analysen å kvantifisere cellen overflaten transport av misfolded rhodopsin mutanter11,13,17. Hvis etiketten rhodopsin på plasma membranen, hoppet vi trinn i cellemembranen permeabilization og immunostained rhodopsin mutanter av et monoklonalt (B6-30) anti-rhodopsin gjenkjenne N-terminal epitope av rhodopsin på ekstracellulære siden av cellen membran18. For å visualisere den muterte rhodopsin i hele cellen, smeltet vi rhodopsin med Venus fluorescens protein. Ved kvantifisering av fluorescens intensiteten i forskjellige fluorescens kanaler er vi i stand til å hente flere parametere i et enkelt eksperiment inkludert totale rhodopsin intensiteten i hele cellen på celleoverflaten og forholdet mellom rhodopsin fluorescens på celleoverflaten som i hele cellen. Bruk denne metoden til å stable celler uttrykke totalt seks misfolded rhodopsin mutanter, kan vi generere en farmakologisk profil av flere små molekyl chaperones mot disse mutanter. I denne protokollen, alle cellene er immunostained i en 384-vel plate og fotografert med et automatisert tenkelig system under en svært konsekvente bildebehandlingsprogrammer tilstand. En bildeanalyser utføres hver brønn, med bilder av mer enn 600 celler og reduserer variasjonen skyldes heterogenitet cellene med varierende form og protein uttrykk cellenivå. Arbeidsflyten denne protokollen summeres i figur 1. Fordelen med denne metoden er at vi får høy oppløsning samt flere parameter quantifications fra image-basert analyse. Generelt kan denne protokollen endres og brukes for å kvantifisere transport av noen misfolded membran proteiner av interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viste vi en høyt innhold tenkelig analysen brukt for å karakterisere treff identifisert fra en HTS. Bare automatisering involvert i disse protokollene er høyt innhold imager. Immunostai- og fluorescens avbilding av rhodopsin har blitt brukt ofte til å beskrive lokaliseringen av rhodopsin5,14,15,16. Men er kvantifisering av bilder tatt av tradisjonelle tenkelig metoder begrenset av mange…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Mark E. Schurdak og University of Pittsburgh Drug Discovery Institute for høyt innhold imager og innledende opplæring. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) delte sjenerøst 1 d-4 og B630 anti-rhodopsin antistoffer. Plasmider som inneholder cDNA av musen rhodopsin-Venus konstruere ble delt av Dr. Nevin Lambert (Augusta University). Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health stipend EY024992 YC og P30EY008098 fra University of Pittsburgh visjon forskning Core grant.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochimie. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
