Um ensaio de transporte Rhodopsin por análise de imagem de alto teor
Summary
Aqui, descrevemos um método de imagem de alto teor para quantificar o transporte dos mutantes rodopsina associado com retinite pigmentosa. Uma análise de múltiplos comprimentos de onda pontuação foi utilizada para quantificar proteína rodopsina na superfície da célula ou a célula inteira.
Abstract
Mutações misfolding rodopsina levam à morte de fotorreceptoras de haste que se manifesta como autossômica dominante retinite pigmentosa (RP), uma progressiva cegueira doença que não tem tratamento eficaz. Nós hypothesize que a citotoxicidade do mutante rodopsina misfolded pode ser atenuada por farmacologicamente a estabilizar a proteína mutante rodopsina. A mutação P23H, entre as outras mutações de rodopsina de classe II, codifica uma proteína mutante rodopsina estruturalmente instável que é acumulada no retículo endoplasmático (ER), Considerando que a rodopsina tipo selvagem é transportada para a membrana plasmática em mamíferos células. Anteriormente realizamos uma tela de alta produtividade baseada em luminescência (HTS) e identificou um grupo de acompanhantes farmacológicas que resgatou o transporte da rodopsina P23H de ER para a membrana plasmática. Aqui, usando um método de imunocoloração seguido por uma análise de imagens de alto teor, podemos quantificar a quantidade de proteína mutante rodopsina na célula inteira e na membrana plasmática. Esse método é eficaz para identificar o verdadeiras correspondências a partir de falsos positivos após HTS e informativo Além disso, a análise de imagem de alto teor nos permitiu quantificar vários parâmetros de uma única experiência para avaliar as propriedades farmacológicas de cada composto. Usando este teste, analisamos o efeito de 11 diferentes compostos para seis RP associado rodopsina mutantes, obtendo um perfil farmacológico de 2-D para uma compreensão quantitativa e qualitativa sobre a estabilidade estrutural desses mutantes rodopsina e a eficácia de diferentes compostos para esses mutantes.
Introduction
Enrolamento de proteínas está envolvido na distrofia muscular, neurais Espinocerebelares, bem como doenças cegantes, incluindo retinite pigmentosa (RP)1. RP é uma degeneração da retina herdada e progressiva, associada com mutações em mais de 60 genes que afetam a função e a homeostase dos FOTORRECEPTORES de haste ou os epitélios pigmentado da retina (RPEs)2,3. Não há tratamento eficaz está atualmente disponível para RP. Rhodopsin mutações representam cerca de 25-30% de autossômica dominante (ad) casos RP. Entre os mais de 150 rodopsina mutações4 (humano Gene mutação de banco de dados, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), as mutações de classe II causam a instabilidade estrutural da proteína rodopsina que contribui para a morte de fotorreceptoras de haste e visão perda5,6,7,8. O P23H é a mutação mais frequente de rodopsina na América do Norte, que também é um exemplo típico da classe II rodopsina mutações9,10. Devido à sua inerente instabilidade estrutural, a rodopsina misfolded é acumulada no retículo endoplasmático (ER) em células de mamíferos, Considerando que a rodopsina tipo selvagem está localizada na membrana plasmática5. A rodopsina misfolded P23H exposições mutante dominante citotoxicidade negativa que não é devido a haploinsuficiência, mas está relacionada com a ativação de ER associado via de degradação de proteínas e a organização do segmento externo haste interrompido. Para aliviar o stress de células fotorreceptoras haste, uma estratégia é estabilizar o dobramento nativo da rodopsina mutante usando um acompanhante farmacológico.
Para atingir este objetivo, realizamos uma tela de alta produtividade baseada em célula (HTSs)11,12,13 usando um ensaio de complementação do fragmento de β-galactosidase para quantificar o mutante de rodopsina P23H transportado no plasma membrana. O protocolo robusto e simples deste ensaio HTS permitiu-nos explorar as atividades de cerca de 79.000 pequenas moléculas para cada tela. No entanto, porque este ensaio HTS lê sinais de luminescência, falsos positivos incluindo os inibidores de β-gal, compostos coloridos ou citotóxicos constam da lista à espera de ser identificado por um ensaio secundário.
O tradicional imunocoloração e métodos da imagem latente de fluorescência tenham usados por anos para estudar o transporte de rodopsina em células de mamíferos5,14,15,16. No entanto, estes métodos convencionais não podem ser usados para quantificar os efeitos farmacológicos de mais de 10 compostos para transporte de rodopsina, porque uma análise confiável de imagem requer um grande número de imagens tiradas sob uma condição altamente consistente, que é não alteráveis pelos métodos convencionais de imagem. Aqui, nós desenvolvemos um protocolo de imagem de alto teor de imunocoloração com base como um ensaio secundário para quantificar o transporte de superfície de célula de misfolded rodopsina mutantes11,13,17. Para rotular rodopsina na membrana plasmática, passámos a etapa de permeabilização da membrana celular e immunostained os mutantes rodopsina por um anticorpo monoclonal (B6-30) antirodopsina reconhecendo o epítopo do N-terminal da rodopsina ao lado extracelular da célula membrana de18. Para visualizar o rhodopsin mutante na célula inteira, nós fundidos rodopsina com a proteína de fluorescência de Venus. Pela quantificação das intensidades de fluorescência em canais de fluorescência diferentes, somos capazes de obter vários parâmetros de uma única experiência, incluindo a intensidade total rodopsina na célula inteira, na superfície da célula e a proporção de fluorescência de rodopsina na superfície da pilha, para que, na célula inteira. Aplicando esse método stable células expressando um total de seis mutantes de misfolded rodopsina, podemos gerar um perfil farmacológico de várias pequenas moléculas chaperones para esses mutantes. Neste protocolo, todas as células são immunostained em uma placa de 384 em fotografaram usando um sistema automatizado de imagens sob uma condição altamente consistente da imagem latente. Uma análise da imagem é realizada para cada poço, contendo imagens de mais de 600 células para reduzir a variação devido à heterogeneidade das células com diferentes a nível de expressão de forma e proteína de célula. O fluxo de trabalho do presente protocolo é resumido na Figura 1. A vantagem deste método é que obtemos imagens de alta resolução, bem como quantificações multi-parâmetros da análise baseada em imagem. Em geral, este protocolo pode ser modificado e aplicado para quantificar o transporte de qualquer membrana misfolded proteínas de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós mostramos um ensaio de alto teor de imagem usado para caracterizar sucessos identificados de um HTS A automação única envolvido nestes protocolos é o gerador de imagens de alto teor. A imunocoloração e imagem latente de fluorescência da rodopsina têm sido utilizados comumente para caracterizar a localização de rodopsina5,14,15,16. No entanto, a quantificação das imagens c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Mark E. Schurdak e Universidade de Pittsburgh Drug Discovery Institute para fornecer o sistema de imagem de alto teor e treinamentos iniciais. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) generosamente compartilhados B630 antianticorpos rodopsina e 4 a 1. O plasmídeo contendo o cDNA do rato rodopsina-Venus construção foi partilhado pelo Dr. Nevin Lambert (Universidade de Augusta). Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de saúde grant EY024992 YC e P30EY008098 de grant do núcleo de pesquisa de visão de Universidade de Pittsburgh.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
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