Ici, nous avons décrit une méthode d’imagerie de haute teneur pour quantifier le transport des mutants de rhodopsine associée à une rétinite pigmentaire. Une analyse de notation d’onde multiples a été utilisée pour quantifier la protéine rhodopsin sur la surface de la cellule ou dans la cellule entière.
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Article de méthode
Un dosage de Transport rhodopsine par analyse de l’imagerie de haute teneur
Dans cet article
Résumé
Résumé
Des mutations de rhodopsine pourrait conduisent à la mort de photorécepteur de tige qui se manifeste comme autosomique dominante rétinite pigmentaire (RP), un progressif aveuglante de maladie qui n’a pas de traitement efficace. Nous émettons l’hypothèse que la cytotoxicité du mutant rhodopsine mal repliées peut être atténuée en stabilisant pharmacologiquement la protéine mutante rhodopsine. La mutation de P23H, parmi les autres mutations de rhodopsine de classe II, code pour une protéine mutante rhodopsine structurellement instable qui s’accumule dans le réticulum endoplasmique (re), alors que la rhodopsine de type sauvage est transporté vers la membrane plasmique dans mammifères cellules. Précédemment, nous avons effectué un écran axée sur la luminescence de haut débit (HTS) et identifié un groupe de chaperons pharmacologiques qui a sauvé le transport de la rhodopsine P23H d’ER à la membrane plasmique. Ici, en utilisant une méthode d’immunomarquage suivie d’une analyse d’imagerie de haute teneur, nous avons mesuré la quantité de protéines mutantes rhodopsine dans la cellule entière et sur la membrane plasmique. Cette méthode est instructive et efficace pour identifier le vrais succès des faux positifs suite HTS En outre, l’analyse d’image haute teneur nous a permis de quantifier plusieurs paramètres d’une expérience unique pour évaluer les propriétés pharmacologiques de chaque composé. À l’aide de ce test, nous avons analysé l’effet de 11 différents composés vers six mutants de rhodopsine RP associé, obtention d’un profil pharmacologique 2D pour une compréhension quantitative et qualitative sur la stabilité structurelle de ces mutants rhodopsine et l’efficacité de différents composés vers ces mutants.
Introduction
Repliement est impliqué dans la dystrophie musculaire, dégénérescence neuronale, ainsi que des maladies aveuglantes, y compris une rétinite pigmentaire (RP)1. RP est une dégénérescence rétinienne héréditaire et progressive associée à des mutations dans plus de 60 gènes affectant la fonction et l’homéostasie des photorécepteurs de la tige ou les épithéliums pigmenté rétinien (RPE)2,3. Aucun traitement efficace n’est actuellement disponible pour RP. Les mutations de rhodopsine représentent environ 25-30 % d’autosomique dominante (ad) cas RP. Parmi les plus de 150 rhodopsine <....
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Protocole
Remarque : La rhodopsine transport dosage.
1. préparation et la Culture de cellules
- Faire revivre cryoconservés U2OS stables cellules exprimant le type sauvage (WT) ou les protéines de fusion de rhodopsine-Vénus souris mutante. Décongeler les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que seulement petits cristaux de glace sont laissés dans le flacon.
Remarque : Les cellules U2OS sont utilisés dans le présent protocole parce qu’il n’y a aucune lignée de cellules photoréceptrices disponibles pour des études in vitro et la biosynthèse des cils de la rhodopsine est régulée par des mécanismes moléculaires similaires dan....
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Résultats
Nous avons caractérisé le transport de la rhodopsine avec trois paramètres : l’intensité de la rhodopsine-Venus dans la cellule entière (rhodopsine-Venus INT), l’intensité de l’immunomarquage de la rhodopsine sur la membrane plasmique (rhodopsine INT sur la surface des cellules) et le ratio de rhodopsin tache sur la surface de la cellule à l’intensité de la rhodopsine-Venus dans la cellule entière (Ratio de MEM-Total). Un résultat représentatif de l’essai de transport rhodopsine est montr.......
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Discussion
Ici, nous avons montré un test d’imagerie haute teneur utilisé pour caractériser les hits identifiés d’une HTS L’automatisation seule impliquée dans ces protocoles est l’imageur de haute teneur. L’immunomarquage et imagerie de fluorescence de la rhodopsine ont été utilisés couramment pour caractériser la localisation de la rhodopsine5,14,15,16. Cependant, la quantification des images prises par.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le Dr Mark E. Schurdak et l’Université de Pittsburgh Drug Discovery Institute for fournissant l’imageur haute teneur et des formations initiales. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) a généreusement partagé le 4 1 et des anticorps anti-rhodopsine B630. Le plasmide contenant le cDNA de souris rhodopsin-Venus construire était partagé par m. Nevin Lambert (Université de Augusta). Ce travail a été soutenu par l’Institut National d’octroi de santé EY024992 YC et P30EY008098 de grant de l’Université de Pittsburgh Vision Research Core.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cellules U2OS (rhodopsine-Vénus) | NA | NA | Cellules stables générées à partir de cellules U2OS |
| Cellules U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) | NA | NA | Cellules stables générées à partir de cellules U2OS |
| Cellules U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) Cellules | NA | NA | Cellules stables générées à partir de cellules U2OS |
| Cellules U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) NA | Cellules stables générées à partir de cellules U2OS | ||
| Cellules U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) | NA | NA Cellules | stables générées à partir de cellules U2OS |
| Cellules U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) NA | NA | Cellules stables générées à partir de cellules U2OS | |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) Cellules | NA | NA | Cellules stables générées à partir de cellules U2OS |
| DMEM à haute teneur en glucose | Genesee Scientific | 25-500 | Avec L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco | 16140071 | Plasmocin Inactivé par la chaleur |
| InvivoGen | ant-mpt | Réactif d’élimination des mycoplasmes | |
| Pénicilline-Streptomycine (100X) | Gibco | 15140122 | 100X solutions antibiotiques concentrées pour prévenir la contamination bactérienne des cultures cellulaires |
| Trypsine-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0,25 %, 1mM EDTA dans HBSS sans calcium et magnésium |
| Solution de poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol poids 70,000-150,000, 0,01 %, stérile-filtré, BioReagent, adapté à la culture cellulaire |
| CellCarrier-384 Ultra Microplaques | PerkinElmer | 6057300 | Microplaques traitées à 384 puits de tissu avec des parois à puits noirs et un fond d’oléfine cyclique optiquement clair pour l’imagerie des cellules dans l’analyse |
| à haut contenuPlaque stérile à 96 puits | Eppendorf | 30730119 | Culture tissulaire traitée avec couvercle à fond plat, stérile, exempte de pyrogènes détectables, de Rnase, de DNase et d’ADN. |
| Sailine tamponnée au phosphate non cytotoxique (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x tampon PBS, pH 7,4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99,5 %, culture cellulaire testée |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Composés testés | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | composés ont été achetés auprès de différents fournisseurs ou synthétisé sur mesure |
| B6-30 anticorps anti-rhodopsine | Novus | NBP2-25160 | Don du Dr Krzysztof Palczewski |
| Cy3 conjugué chèvre anti-souris anticorps secondaire | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16 % paraformaldéhyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Sans méthanol |
| 10 % Sérum de chèvre normal | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Tampon de blocage |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Solution de coloration nucléaire |
| Imageur à haut contenu | Dispositifs moléculaires | ImageXpress | ImageXpress® ; Système d’imagerie micro-confocal à haut contenu |
| Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images à haut contenu MetaXpress | Dispositifs moléculaires Logiciel | d’acquisition et d’analyse d’images à haut contenu | MetaXpress |
| Pipette multicanaux (0,5-10 & micro ; L) | Rainin | 17013802 | Pipette manuelle à 8 canaux, 0,5-10 & micro ; L |
| Pipette multicanaux (0,5-10c | Rainin | 17013805 | Pipette manuelle à 8 canaux, 20-200 & micro ; L |
| Pipette électronique multicanaux (10-200 &mu ; L) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Pipette électronique multicanal pour le pipetage de microplaques à 96 et 384 puits |
| Réservoir de réactifs | Genesee Scientific | 28-125 | Réservoir de réactifs pour distribution de pippte multicanaux |
| Aspirateur à 8 canaux | ABC Scientific | EV503 | Adaptateur en acier inoxydable à 8 canaux pour l’aspiration de liquides à partir de plaques à 96 ou 384 puits |
| Excel tableur | Microsoft | Excel2016 | Le tableur pour l’analyse de données et la génération de cartes thermiques |
| Origin2018 Logiciel d’analyse de données scientifiques et de graphiques | OriginLab | Origin2018 | Le logiciel d’analyse de données pour générer les courbes dose-réponse |
Références
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. <....
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Réimpressions et autorisations
