Rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından
Summary
Buraya, taşıma retinitis pigmentosa ile ilişkili rhodopsin mutantların ölçmek için bir yüksek-içerik görüntüleme yöntemi nitelendirdi. Bir çoklu dalga boyu Puanlama analiz rhodopsin protein hücre yüzeyine veya tüm cep telefonu ölçmek için kullanıldı.
Abstract
Rhodopsin misfolding mutasyonlar otozomal dominant retinitis pigmentosa (RP), etkili tedavi yoksun hastalığı kör bir ilerici kendini gösteren çubuk photoreceptor ölüme yol açar. Misfolded rhodopsin mutant sitotoksisite farmakolojik mutant rhodopsin protein sabitleme ile hafifletti öngörmekteyiz. Vahşi türü rhodopsin memeli plazma zarı için taşınır, ancak diğer sınıf II rhodopsin mutasyonlar arasında P23H mutasyon endoplazmik retikulum (ER), birikmiş bir yapısal olarak kararsız rhodopsin mutant protein kodlar hücreleri. Biz daha önce bir ışıldama tabanlı yüksek üretilen iş ekran (HTS) gerçekleştirilen ve ER üzerinden P23H rhodopsin plazma zarı için taşıma kurtarıldı farmakolojik chaperones bir grup tespit. Burada, bir yüksek-içerik görüntüleme analizi tarafından takip bir immunostaining yöntemini kullanarak, biz mutant rhodopsin protein miktarı tüm cep telefonu ve plazma zarı sayılabilir. Bu bilgilendirici ve yanlış pozitif HTS. takip üzerinden gerçek sayısı tanımlamak etkili bir yöntemdir Ayrıca, yüksek-içerik görüntü analizi bize birden çok parametre her bileşik farmakolojik özellikleri değerlendirmek için tek bir deneme ölçmek etkinleştirilmiş. Bu tahlil kullanılarak, biz bu rhodopsin mutantların yapısal kararlılık ilgili nicel ve nitel bir anlayış için bir 2-B farmakolojik profil alma altı ilişkili RP rhodopsin mutantlar doğru 11 farklı bileşiklerin etkisi analiz ve bu mutant doğru farklı bileşiklerin etkinliği.
Introduction
Protein misfolding retinitis pigmentosa (RP)1de dahil olmak üzere, kör edici hastalıklar gibi kas distrofisi, sinirsel dejenerasyonlar içinde yer almaktadır. RP devralınan ve ilerici Retina dejenerasyonu işlev ve çubuk photoreceptors veya Retina pigmentli hücreleri (RPEs)2,3homeostazı etkileyen 60 genlerdeki mutasyonlar ile ilişkili olduğunu. Etkili bir tedavi RP için şu anda mevcuttur. Rhodopsin mutasyonlar otozomal dominant (reklam) yaklaşık % 25-30 RP durumlarda hesaba. 150’den fazla rhodopsin mutasyonlar4 arasında (insan gen mutasyon veritabanı, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), sınıf II mutasyonlar çubuk photoreceptor ölümüne katkıda rhodopsin protein yapısal kararsızlığına neden ve Vizyon kaybı5,6,7,8. P23H da sınıf II rhodopsin mutasyonlar9,10tipik bir örneği ile Kuzey Amerika’da en sık rhodopsin mutasyon var. Vahşi türü rhodopsin plazma zarı5üzerinde yer alır, ancak onun doğasında yapısal istikrarsızlık nedeniyle memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum (ER) içinde misfolded rhodopsin birikmiş. Misfolded rhodopsin haploinsufficiency nedeniyle değil, ama ER harekete geçirmek için ilgili P23H mutant sergiler baskın olumsuz sitotoksisite protein yıkımı yolu ve kesilen çubuk dış segment organizasyon ilişkili. Çubuk photoreceptor hücre stresi hafifletmek için bir strateji yerel farmakolojik bir koruyucuya kullanarak mutant rhodopsin katlama stabilize etmektir.
Bu hedefe ulaşmak için biz gerçekleştirilen plazma üzerinde taşınan P23H rhodopsin mutant ölçmek için bir β-galaktozidaz parçası uluslara tahlil kullanarak bir hücre tabanlı yüksek üretilen iş ekran (HTSs)11,12,13 membran. Güçlü ve basit iletişim kuralı bu HTS testin bize her ekran için yaklaşık 79.000 küçük moleküller faaliyetlerinin keşfetmek etkin. Çünkü bu HTS tahlil ışıldama sinyalleri okur, ancak, yanlış pozitif β-gal inhibitörleri dahil olmak üzere renkli ya da sitotoksik bileşikler tarafından ikincil bir tahlil tespit edilmesi için bekleyen bulunanlar listesinde dahil.
Geleneksel immunostaining ve floresan görüntüleme yöntemleri yıllardır memeli hücreleri5,14,15,16rhodopsin taşımada eğitim için kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel yöntemlerin güvenilir bir görüntüleme analizi çok sayıda olduğunu son derece tutarlı bir koşul altında çekilen görüntüler gerektirdiğinden rhodopsin taşıma doğru 10’dan fazla bileşiklerin farmakolojik etkileri ölçmek için kullanılamaz konvansiyonel görüntüleme yöntemleri tarafından değil iyileştirilebilir. Burada, bir immunostaining göre yüksek içerik görüntüleme Protokolü hücre yüzey taşıma misfolded rhodopsin mutantlar11,13,17ölçmek için ikincil bir tahlil olarak geliştirdi. Plazma zarı üzerinde rhodopsin etiketlemek için hücre zarının permeabilization ve immunostained adımında rhodopsin mutantlar rhodopsin hücre hücre dışı kenarındaki N-terminal epitope tanıma monoklonal (B6-30) Anti-rhodopsin tarafından atladık membran18. Tüm cep telefonu mutant rhodopsin görselleştirmek için rhodopsin Venüs floresans protein ile erimiş. Tarafından miktar farklı floresan kanalları floresans yoğunluklarını, biz bir tek deneme her hücresinde, hücre yüzeyine ve oranı toplam rhodopsin yoğunluğu da dahil olmak üzere birden çok parametre elde edebiliyoruz Tüm cep telefonu için bu hücre yüzeyinde rhodopsin floresan. Toplam altı misfolded rhodopsin mutantlar ifade hücreleri kararlı için bu yöntemi uygulayarak, biz bu mutant doğru birden çok küçük molekül chaperones farmakolojik bir profil oluşturabilirsiniz. Bu iletişim kuralı, tüm hücreleri immunostained 384-şey plaka vardır ve son derece tutarlı bir görüntüleme koşulu altında otomatik görüntüleme sistemi kullanarak yansıma. Bir görüntü analizi görüntüleri heterojenite nedeniyle değişim hücre şekil ve protein ifade düzey değişen hücre azaltmak için 600’den fazla hücre içeren her şey yapılır. İş akışını bu iletişim kuralı, Şekil 1‘ de özetlenmiştir. Bu yöntemin avantajı biz yansıma tabanlı analiz çok parametreli quantifications yanı sıra yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde var. Genel olarak, bu iletişim kuralı değiştirilmiş ve herhangi bir misfolded membran protein ilgi taşımacılığının ölçmek için uygulanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bir HTS. tespit sayısı karakterize için kullanılan bir yüksek-içerik görüntüleme tahlil ortaya Bu iletişim kuralları dahil tek Otomasyon yüksek içerikli Imager var. İmmunostaining ve floresan görüntüleme rhodopsin rhodopsin5,14,15,16lokalizasyonu karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel görüntüleme yöntemleri tarafından çekilen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Mark E. Schurdak teşekkür ve Pittsburgh Üniversitesi ilaç Discovery Enstitüsü için-mek şartıyla yüksek-içerik Imager ve ilk eğitimler. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve Üniversitesi) cömertçe 1 d 4 ve B630 Anti-rhodopsin antikorlar paylaştı. Fare rhodopsin-Venus yapı cDNA içeren plazmid Dr. Nevin Lambert (Augusta Üniversitesi) tarafından paylaşıldı. Bu eser Pittsburgh Üniversitesi vizyon araştırma çekirdek grant YC ve P30EY008098 sağlık hibe EY024992 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochimie. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
