Det här protokollet beskriver de allmänna processerna och kvalitetskontroll kontroller som krävs för att förbereda friska vuxna enda däggdjursceller droplet-baserade, hög genomströmning enda cell RNA-Seq preparat. Sekvensering parametrar, finns Läs justering och nedströms encelliga bioinformatiska analyser också.
Analys av enstaka cell genuttryck över tusentals enskilda celler i en vävnad eller närmiljön är ett värdefullt verktyg för att identifiera cell sammansättning, diskriminering av funktionellt påstår och molekylära vägar bakomliggande observerade vävnad funktioner och djurs beteenden. Isolering av intakt, friska enstaka celler från vuxna däggdjur vävnader för efterföljande nedströms enda cell molekylär analys kan dock vara utmanande. Det här protokollet beskriver de allmänna processerna och kvalitetskontroll kontroller behövs för att få hög kvalitet vuxen enda cell preparat från nervsystemet eller hud som aktiverat efterföljande opartisk enda cell RNA-sekvensering och analys. Riktlinjer för nedströms bioinformatiska analyser finns också.
Med utvecklingen av hög genomströmning enda cell teknik1,2 och framsteg inom användarvänliga bioinformatiska verktyg över de senaste decenniet3, har ett nytt fält av högupplösta gen uttryck analys uppstått – encelliga RNA-sekvensering (scRNA-Seq). Studien av enstaka cell genuttryck utvecklades först att identifiera heterogenitet inom definierade cellpopulationer, såsom i stamceller eller cancerceller, eller för att identifiera sällsynta populationer av celler4,5, som var ouppnåeliga använder traditionell bulk RNA-sekvensering tekniker. Bioinformatiska verktyg har aktiverat identifiering av romanen subpopulationer (Seurat)2, visualisering storleksordningen celler längs ett psuedotime utrymme (Monocle)6, definitionen av aktiva signalering nätverk inom eller mellan populationer ( NATURSKÖNA)7, prediktion av montering av singel-celler i en konstgjord 3D-rymden (Seurat, och mer)8. Med dessa nya och spännande analyser finns tillgängliga för det vetenskapliga samfundet, scRNA-Seq är snabbt på att bli den nya standarda metoden för gen uttryck analys.
Trots den stora potentialen hos scRNA-Seq, kan tekniska skillsets krävs för att producera en ren datamängd och korrekt tolka resultaten vara utmanande att nykomlingar. Här, ett grundläggande, men omfattande protokoll, start från isoleringen av enstaka celler från hela primära vävnader till visualisering och presentation av data för publikationen presenteras (figur 1). Först, isolering av friska enstaka celler kan anses vara utmanande, eftersom olika vävnader varierar i deras grad av känslighet för enzymatisk nedbrytning och efterföljande mekaniska dissociation. Detta protokoll ger vägledning i stegen isolering och identifierar viktiga kvalitetskontroll kontrollpunkter i hela processen. Andra, förstå kompatibilitet och krav mellan singelcellteknologi och nästa generations sekvensering kan vara förvirrande. Detta protokoll ger riktlinjer för att genomföra en användarvänlig, droplet-baserade encelliga streckkodning plattform och utföra sekvensering. Slutligen, datorprogrammering är en viktig förutsättning för att analysera encelliga transcriptomic datamängder. Detta protokoll innehåller resurser för att komma igång med programmeringsspråket R och ger vägledning om genomföra två populära scRNA-Seq-specifika R paket. Tillsammans, kan detta protokoll vägleda nykomlingar i utföra scRNA-Seq analys för att få tydliga och tolkningsbara resultat. Detta protokoll kan anpassas till de flesta vävnader i musen, och allt kan ändras för användning med andra organismer, inklusive mänsklig vävnad. Justeringar beroende på vävnad och användaren kommer att krävas.
Det finns flera faktorer att ha i åtanke när du följer detta protokoll; inklusive, 1) efter alla kvalitetskontroll riktlinjer i steg 1 och 2 i detta protokoll rekommenderas att garantera en livskraftig enda cellsuspension av alla celler i provet av intresse samtidigt som man säkerställer korrekta totala antalet blodkroppar (sammanfattas i figur 2 ). När detta uppnås, och om alla optimerade villkor följs, kvalitetskontroll stegen kan släppas (Spara tid – bevara RNA kvalitet och minska celler förlust). Bekräftar framgångsrika isolering av hög bärkraft enstaka celler från vävnaden av intresse är starkt rekommendera innan något nedströms bearbetning. (2) eftersom vissa celltyper är mer känsliga än andra för att betona, kan Överdriven dissociation tekniker oavsiktligt bias befolkningen, därför confounding nedströms analys. Mild dissociation utan onödiga cellulära klippning och matsmältningen är kritiska för att uppnå hög cellulära avkastning och en korrekt representation av vävnadssammansättning. Skeva styrkor inträffa under sönderdelning, FACS och resuspension stegen. (3) som med varje RNA-arbete, är det bäst att presentera som lite extra RNase i provet som möjligt under beredning. Detta kommer att bidra till att upprätthålla hög kvalitet RNA. Använda ribonunkleas hämmare lösningar med sköljning till rena verktyg och utrustning som inte RNase-fri men undvika DEPC-behandlad produkter. (4) utför förberedelserna så snabbt som möjligt. Detta hjälper upprätthålla hög kvalitet RNA och minska celldöd. Beroende på vilken vävnad dissektion längd och djurens antal, överväga att starta flera dissektioner/preparat samtidigt. (5) Förbered celler på is när möjligt att upprätthålla hög kvalitet RNA, minska celldöd och långsam cell signalering och transkriptionell aktivitet. Om än, iskall bearbetning är idealisk för de flesta celltyper, presterar vissa celltyper (t.ex., neutrofiler) bättre när bearbetas vid rumstemperatur. (6) undvika kalcium, magnesium, EDTA och DEPC-behandlad produkter under cell beredning.
Detta protokoll visar hur den lämplig preparering av enstaka celler kan avslöja tusentals enstaka celler transkriptionell heterogenitet och diskriminera funktionellt påstår eller unika cellulära identiteter i en vävnad. Protokollet kräver inte fluorescerande reporter proteiner eller transgena verktyg och kan användas till isolering av enstaka celler från olika vävnader av intresse även från människor; att hålla i åtanke varje vävnad är unik och detta protokoll kommer att kräva en viss justering/ändring.
De mångsidiga och högdynamiska transkriptionell program inom celler har betonat värdet av encelliga genomik. Bortsett från isolera högkvalitativa RNA, är ett avgörande prov förberedelse steg nödvändigt för hög kvalitet datamängder att säkerställa att celler frigörs helt från vävnad och att celler är frisk och intakt. Detta är relativt rakt fram för att samla celler som lätt släppt, såsom cirkulerande celler eller vävnader celler behålls där löst, såsom i lymfvävnad. Men detta kan vara utmanande för andra vuxna vävnader, på grund av det välutvecklade cellulära arkitektur som spänner över stort distanserar, omgivande extracellulära matrix och de ofta-styv cytoskeletal proteinerna som är inblandade i att upprätthålla cellstruktur. Även med lämpliga dissociation tekniker för den fullständiga versionen av celler finns det potential att den rigorösa och ofta långdragna bearbetning som krävs skulle ändra mRNA kvalitet och cell integritet. Dessutom, påverka de höga temperaturer som används för enzym-assisted dissociation också transkriptionell signaturer29,30. Syftet med protokollet är att presentera kvalitetskontroll kontroller, använda vävnader såsom myeliniserade vuxen nerven och extracellulära matrix-rika vuxen huden, för att visa hur optimering kan bidra till att övervinna dessa hinder.
En viktig fråga vid utformningen av alla scRNA-Seq experiment är valet av sekvensering djup. Sekvensering kan vara mycket multiplexerade och läsa djup kan variera från att vara mycket låg med Drop-Seq2 till upp till 5 miljoner läsningar per cell14 metoden en fullängds RNA-Seq såsom Smart-följande punkter De flesta scRNA-Seq experiment kan upptäcka måttlig till hög uttryck avskrifter med sekvensering så låg som 10 000 läsningar/cell, vilket är normalt tillräcklig för cell typ klassificering41,42. Grunt sekvensering djup är av värde att spara på sekvensering kostnader när du försöker upptäcka sällsynta cellpopulationer över komplexa vävnader där tusentals celler kan behövas att tryggt tillskriva sällsynta populationer. Men grunt djup sekvensering är inte lämplig när detaljerad information om genuttryck och processer associerade med subtila transkriptionell signaturer krävs. För närvarande, uppskattas det att en stor majoritet av gener i en cell upptäcks med 500.000 läsningar/cell, men detta kan variera beroende på protokollet och vävnad typ43,44. Fullängds avskrift sekvensering kringgår behovet av montering och kan därför upptäcka roman eller sällsynta skarv varianter, begränsa sekvensering kostnader ofta skalning sådana tillvägagångssätt för att undersöka tusentals celler bestående av ett komplex vävnad system. Däremot taggade 3′ encelliga bibliotek såsom de som beskrivs i detta protokoll vanligtvis har lägre komplexitet och kräver grundare sekvensering. Det är viktigt att notera att bibliotek som genereras med hjälp av beskrivna protokollet kan sekvenseras på en av fem stöds sequencers: 1) NovaSeq, (2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 snabb kör och hög effekt, 4) NextSeq 500/550 och 5) MiSeq.
En alternativ strategi för enstaka cell RNA-Seq, som minskar behovet av delikat vävnads- och hantering ännu bevarar några av fördelarna med enstaka cell RNA-Seq, är analysen av RNA från enda atomkärnor45. Detta tillvägagångssätt tillåter snabbare bearbetning minska RNA nedbrytning, och mer extrema åtgärder för att säkerställa adekvat frisättning av kärnor, och således sannolikt möjliggör en mer självsäker fånga av transkriptionell profiler som representerar alla celler i en viss vävnad. Detta skulle, naturligtvis, endast ge en del av aktiviteten transkriptionell inom en given cell, således beroende på vad experimentella mål är av intresse detta tillvägagångssätt kan eller inte kan vara lämpliga.
Förutom fullständig karakterisering av cellulära identiteter inom en viss vävnad är en av de mest värdefulla analyserna för scRNA-Seq datamängder bedömningen av transkriptionell mellanlägen över ‘definierade’ cellpopulationer. Dessa förmedlande stater kan ge insikter om härstamning relationerna mellan celler inom identifierade populationer, vilket inte var möjligt med traditionella bulk RNA-Seq närmar sig. Flera scRNA-Seq bioinformatiska verktyg har nu utvecklats för att belysa detta. Sådana verktyg kan bedöma de processer som är involverade i, till exempel cancerceller som övergår till en onkogen/metastaserad stat, stamceller mognar till olika terminal öden eller immunceller skytteltrafik mellan aktivt och quiescent. Subtila transkriptom skillnader i celler kan också vara vägledande av härstamning fördomar att nyligen utvecklade bioinformatiska verktyg som FateID, kan härleda47. Eftersom skillnaderna mellan övergår celler kan vara svårt att få klarhet i tanke transkriptionell skillnaderna kan vara subtil, djupare sekvensering kan vara nödvändiga46. Lyckligtvis, täckning av ett grunt sekvenserade bibliotek kan ökas om intresserad sondera datamängden ytterligare genom att åter köra biblioteket på en annan flöde cell.
Detta protokoll tillsammans och ger en lätt-till-adapt arbetsflöde som möjliggör för användare att transcriptionally profilera hundratals till tusentals singel-celler inom ett experiment. Den slutliga kvaliteten på en scRNA-Seq datamängd är beroende av optimerad cell isolering, flödescytometri, cDNA bibliotek generation och tolkning av rå gen-barcode matriser. I detta syfte ger detta protokoll en omfattande överblick över alla viktiga steg som enkelt kan ändras för att möjliggöra studier av olika vävnadstyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stödpersonal vid anläggningen i UCDNA tjänster, liksom djur vård anläggning Personalen på University of Calgary. Vi tackar Matt Workentine för uppbackningen bioinformatik och Jens Durruthy för hans teknisk support. Detta arbete var finansieras av ett CIHR bidrag (R.M. och J.B.), en CIHR nya Investigator Award till J.B. och en Alberta barns hälsa forskning Institutet Fellowship (JS).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |