Enquête de dépendances génétiques utilisant la concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode de base CRISPR-Cas9 de groupés régulièrement entrecoupées court palindromique répète (CRISPR) pour une enquête rapide et simple du rôle de plusieurs gènes candidats à la prolifération des cellules de la leucémie myéloïde aiguë (AML) Parallèlement. Cette technique est évolutive et peut être appliquée dans les autres lignées cellulaires cancéreuses ainsi.

Résumé

Études de perturbation de gènes ont été utilisés intensivement pour enquêter sur le rôle des gènes individuels dans la pathogenèse de l’AML. Pour la réalisation complète du gène perturbation, beaucoup de ces études ont fait l’utilisation de modèles knock-out gène complexe. Bien que ces études sur des souris knockout offrent un système élégant et ayant fait leurs preuves pour enquêter sur les relations génotype-phénotype à, une méthode rapide et évolutive pour l’évaluation des gènes candidats qui jouent un rôle dans la prolifération cellulaire AML ou la survie dans les modèles AML aidera à accélérer l’interrogatoire parallèle de plusieurs gènes candidats. Les progrès récents dans les technologies de modification du génome ont amélioré considérablement notre capacité à effectuer des perturbations génétiques à une échelle sans précédent. Un tel système de modification du génome est la méthode CRISPR dotés de Cas9 qui permet d’effectuer des modifications rapides et efficaces dans le génome de cellules cibles. La simplicité et l’évolutivité des CRISPR/Cas9-mediated gene-suppression rend une des techniques plus attrayants pour l’interrogatoire d’un grand nombre de gènes dans des tests phénotypiques. Nous présentons ici un essai simple avec CRISPR/Cas9 médiée par gène-perturbation combinée à haut-débit débit-cytometry-concurrence fondée sur les dosages d’enquêter sur le rôle des gènes qui peuvent jouer un rôle important dans la prolifération ou la survie de l’homme et lignées de cellules murines AML.

Introduction

Les dernières décennies ont vu les nombreux efforts de recherche axés sur l’identification de la contribution des principales voies moléculaires dans la pathogenèse de la leucémie myéloïde aiguë (AML). Traditionnellement, disruption de génique dans les cellules de Lam a été réalisée à l’aide de la souris knock-out conditionnel ou court-hairpin RNA (Sharn). Tandis que chez des souris knockout offrent un système sophistiqué de contrôle spatio-temporelle de la délétion de gène, générant des souris knockout gène est fastidieux, long et coûteux. En outre, gène-coups de grâce à l’aide de stratégies de recombinaison n’est pas facilement évolutive ; ces stratégies ne se prête....

Protocole

1. générer AML Cell Line Clones avec forte Expression de Cas9 Stable et Active

1. Production de Cas9 lentivirus
   1. Jour 0 : Plaque 4 x 10⁶ 293 t cells dans 10 mL de DMEM avec 10 % sérum fœtal (SVF) et de la pénicilline et de L-glutamine dans un plat de culture de tissu de 10 cm dans un niveau 2 de biosafety (BSL2) certifié hotte de culture cellulaire. Placer le plat dans un incubateur à 37 ° C.
   2. Jour 1 : Les cellules 293 t plaqué devraient être 70 – 80 % anastomosé au jour 1. Effectuer la transfection utilisant le protocole suivant dans l’après-midi.
   3. Réchauffer le moyen de transfection, de milieux de cultu....

Résultats

Dans notre étude, nous avons tout d’abord transduites la MOLM13 humaine AML lignée qui porte la translocation de MLL-AF9 avec haut-titre virus codant le plasmide lentiviraux Cas9-blasticidine. Dans nos mains, en vrac non triées de cellules MOLM13-Cas9 ne manifestaient pas de haut niveau d’expression Cas9 Western Blot et n’a pas exécuté aussi bien quand le dosage efficace gène édition-à l’aide de la méthode décrite précédemment⁷. Par conséquent, nous avons procédé à.......

Discussion

Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour effectuer un test de croissance compétitive CRISPR dotés de Cas9 pour enquêter sur le rôle des gènes candidats dans des lignées cellulaires AML cytométrie-dans les cellules humaines/murin AML (Figure 5). L’objectif du test est d’identifier l’effet de la suppression du gène sur l’entretien de la prolifération cellulaire AML pendant deux à trois semaines sur une échelle de débit moyen. Certaines étapes critiques doivent être s.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FLAG-M2 Anticorps	sigma-aldrich	F3165, lot # SLBS3530V
Anticorps anti-souris	Invitrogen	31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Substrat à sensibilité maximale	Thermo Fisher	34095
Système d’imagerie ChemiDoc	BIO RAD	17001401
Centrifugeuse Sorvall Legend RT	Thermo Scientific
Blasticidine	Thermo Fisher	R21001
SYTOX Rouge	Thermo Fisher	S34859
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
DMEM	Thermo Fisher	11965-092
RPMI	Thermo Fisher	11875-093
Pénicilline-Streptomycine	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
Sérum fœtal bovin (FBS)	SAFC	12303C
vecteur unique d’ARNg	Addgene #67974	pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Kit d’extraction nucléaire	sigma-alorich	NXTRACT
XtremeGENE 9	sigma-alorich	6365787001
Rétronectine	Takara	T100B
Cytomètre en flux	BD Biosciences
T4 PNK	NEBioLabs	M0201S
Tampon de ligature de l’ADN T4	NEBioLabs	B0202S
Enzyme T4 DNA Ligase	NEBioLabs	M0202S
Ampicilline	Fisher scientifique	BP1760-25
LB agar	Fisher scientific	BP9724-500
LB Bouillon	Fisher scientific	BP9731-500
Qiagen mini-prep kit	Qiagen	27104
NanoDrop Spectrophotomètre Thermo	Fisher	NanoDrop One
Recombinant Murin IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant Murin IL-6	Peprotech	216-16
Souris recombinante M-CSF	Peprotech	315-02
Cellules stables et compétentes	NEBiolabs	C3040I
10 cm Boîtes de culture tissulaire	Fisher Scientific	353003
Solution de précipitation des protéines	Qiagen	158910
Solution d’hydratation de l’ADN	Qiagen	158914
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BbSI	New England BioLabs	R0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit	Genessee Scientific	42-138
Puromycin	Fisher scientific	BP2956100
50 mL tubes	coniques en polypropylèneFisher scientific	1495949A
Tubes coniques en polypropylène de 15 mL	Fisher scientific	1495970C

Solution de lyse cellulaire Qiagen 158906