Utredning av genetiska beroenden med CRISPR-Cas9-baserade konkurrens analyser
Summary
Detta manuskript beskriver en klustrad regelbundet mellanliggande kort Palindromic upprepas (CRISPR) CRISPR-Cas9-baserade metod för enkel och snabb undersökning av flera kandidatgener i akut myeloisk leukemi (AML) cellproliferation i roll parallellt. Denna teknik är skalbar och kan appliceras i andra cancer cellinjer samt.
Abstract
Gen störning studier har använts i stor utsträckning att undersöka betydelsen av enskilda gener i AML patogenes. För att uppnå fullständig gen störningar, många av dessa studier har gjort användningen av komplexa gen knockout modeller. Medan dessa studier med knockoutmöss erbjuder ett elegant och beprövade system för att undersöka genotyp-till-fenotyp relationer, en snabb och skalbar metod för att bedöma kandidatgener som spelar en roll i AML cellproliferation eller överlevnad i AML modeller hjälper påskynda parallell förhör av flera kandidatgener. Senaste framstegen inom editering teknik har dramatiskt förbättrat vår förmåga att utföra genetiska störningar på en aldrig tidigare skådad omfattning. Ett sådant system av gen editering är metoden CRISPR-Cas9-baserad som kan användas för att göra snabba och effektiva förändringar i målet cellen genomet. Den lätthet och skalbarhet av CRISPR/Cas9-medierad gen-strykningen gör det en av de mest attraktiva teknikerna för förhör av ett stort antal gener i fenotypisk analyser. Här presenterar vi en enkel test som använder CRISPR/Cas9 medierad gen-störningar i kombination med hög genomströmning flöde-flödescytometri-baserade konkurrens-analyser för att undersöka rollen av gener som kan spela en viktig roll i spridningen eller överlevnad av mänskliga och murina AML cellinjer.
Introduction
De senaste decennierna har sett många forskningsinsatser inriktad på att identifiera viktiga molekylära vägar i akut myeloisk leukemi (AML) patogenes bidrag. Traditionellt, har gen-störningar i AML celler utförts med villkorlig knockoutmöss eller kort-hårnål RNA (shRNA). Medan knockoutmöss erbjuder ett sofistikerat system för plats och tid kontroll av gen-strykningen, är generera gen knockoutmöss arbetsintensiva, tidskrävande och dyrt. Dessutom gen-knockouts använda rekombination strategier är inte enkelt skalbar; dessa strategier lämpar inte sig väl till förhör av flera gener parallellt. Efter upptäckten av RNA interferens metoder att knock-down endogena mRNA med små störande RNA (siRNA) eller shRNA, började många grupper använder RNA interferens tekniker för att undersöka betydelsen av specifika gener i AML. Eftersom både murina och mänskliga AML celler är notoriskt svårt att transfect med traditionella lipid-baserade transfection metoder, de flesta studier anställd lentivirally eller retrovirally-kodade shRNA för att studera geners funktion i AML celler. Den senaste upptäckten av klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) och de associerade Cas nukleaser (CRISPR-Cas9) har revolutionerat gen-inriktning teknik1,2,3. Använda CRISPR-Cas9, specifika gener eller genomisk regioner kan tas bort, redigeras eller märkta med effektivitet och lätthet. CRISPR-Cas9-baserade genredigering växer nu fram som metod för val för att utreda genotyp-till-fenotyp relationer i olika celltyper på grund av den enkelhet, effektivitet och bred tillämpligheten av denna teknik. CRISPR-Cas9-baserade metoder blir också metoden för val i AML, inte bara för förhör enskilda gener, men också som ett sätt att rikta flera gener i klädd eller poolade genetiska skärmar som syftar till att undersöka flera gener parallellt som potentiell AML-beroenden4,5,6.
I detta manuskript beskriver vi en enkel konkurrenskraftig tillväxt test för att mäta effekterna av gen-störningar på tillväxten av AML-celler, baserat på stabil CRISPR-Cas9-medierad genredigering följt av hög genomströmning flödescytometri. Denna metod är enkel, effektiv och skalbar till medium-genomströmning experiment för att undersöka rollen av flera gener parallellt i AML celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript beskriver vi ett detaljerat protokoll för att bedriva en CRISPR-Cas9-baserade konkurrenskraftiga tillväxt analys för att undersöka betydelsen av kandidatgener i AML cellinjer med flödescytometri i mänskliga/murin AML celler (figur 5). Målet med analysen är att identifiera effekten av genen radering på underhåll av AML cell spridning över två till tre veckor på en medium-genomströmning skala. Vissa kritiska steg måste följas noggrant för att underlätta upp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCW-Cas9 plasmiden var en present från Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmid # 50661) och den pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – W plasmid från Yusa lab (Addgene plasmid #67974. Vi vill tacka flödescytometri kärnan på SBP medicinsk Discovery Institute för snabb hjälp med Flödesanalys och sortering. Vi skulle vilja erkänna stöd av stiftelsen Lady Tata Memorial till e.Kr. Vi vill också erkänner stöd av de följande finansieringskällorna: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponsrade Grant, V-stiftelsen och San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
