淋巴瘤组织学标本中多路荧光组织化学染色、成像与分析
Summary
在这里, 我们描述了一个协议的多重荧光免疫组化染色和成像同时定位的多种癌症相关抗原在淋巴瘤。该协议可推广到所有组织切片中生物标志物的共化分析。
Abstract
免疫组织化学 (ihc) 方法用于光镜原位分析蛋白质表达, 是研究和诊断的有力工具。然而, 使用常规显色 ic 在单个组织切片中对多种抗原进行可视化和定量是具有挑战性的。多路成像在淋巴瘤的研究和诊断中尤其重要, 在淋巴瘤的研究和诊断中, 标记必须在复杂的肿瘤微环境中进行解释。在这里, 我们描述了多路复用荧光 ihc 染色的协议, 以便能够定量评估淋巴瘤中感兴趣的特定细胞类型中的多个目标。该方法包括抗体验证、抗体优化、淋巴瘤亚型标记物的多重优化、组织微阵列 (tma) 幻灯片的染色以及幻灯片的扫描, 然后进行数据分析, 并具有特定的特征指淋巴瘤。使用这种方法, 产生的平均强度的兴趣标记和百分比阳性产生, 以方便进一步的定量分析。多路复用最大限度地减少了样本利用率, 并为每个感兴趣的标记提供了空间信息。
Introduction
淋巴肿瘤是由淋巴细胞不受控制的恶性增殖引起的。这些细胞是免疫系统的重要组成部分, 并定位到主要和次要免疫器官, 如骨髓、淋巴结、脾脏和其他黏膜相关的淋巴系统。淋巴肿瘤是一种异质性疾病, 根据包括形态学、免疫表型、遗传特征和临床表现在内的一系列特征进行分类。虽然每个参数都有一定的作用, 但谱系仍然是一个决定性的特征, 并构成世卫组织分类系统的基础, 该系统识别来自 b 细胞、t 细胞和自然杀伤细胞1的肿瘤。
淋巴瘤分类的关键一直是对白细胞表面标记抗体的鉴定, 对淋巴细胞的各种亚型2。免疫组织化学 (ihc) 传统上被用于分析此类标记, 并基于特定的抗原抗体识别原理, 以检测可通过光学显微镜显示的细胞和组织分子3. 然而, 传统的光场显色多体 ihc 在单个幻灯片上识别多个目标有局限性, 因为通常很难可靠地区分单个组织部分上的多个颜色信号, 尤其是对于具有很低表达的抗原4。对染色进行视觉评估和定量也可能是主观的, 导致分析和数据解释的可变性5。
因此, 传统的 ihc 在福尔马林固定, 石蜡嵌入 (ffpe) 样品是不可行的同时检测多个目标的免疫多样化的疾病, 如淋巴瘤。此外, 区分肿瘤淋巴细胞和周围的免疫细胞往往是不精确的。这阻碍了研究新的生物标志物在淋巴瘤中的相关性。在这种情况下, 多重荧光 ihc (mf-ihc) 提供了一个很有希望的替代方案, 因为它允许定量评估抗原共表达和空间关系的更高的精度, 同时保存有限的样本6,7.当该成像技术与数字图像分析软件结合使用时, 数据解释效率更高, 便于肿瘤和微环境异质性的研究 8,9。在本协议中, 采用了基于类型的免疫荧光 (if) 复用方法来放大信号, 并与任何寄主物种 (即使是在同一物种5、7中开发的) 经过 ihc 验证的任何抗体兼容,10. 基于类型的协议允许荧光体与感兴趣的组织直接结合, 以便在每一步之后都能去除原发抗体和二级抗体, 从而可以连续应用多个污渍没有抗体交叉反应性。
多路复用策略将有助于预测预后和治疗结果, 通过确定目标及其变异的免疫模式在淋巴瘤。多倍荧光 ihc 已在我们的实验室中应用于血管免疫细胞 t 细胞淋巴瘤 (aita) 中 t 和 b 淋巴细胞标记组和 t-滤泡辅助标记的研究, 这是一种具有攻击性临床特征的外周细胞淋巴瘤的亚型行为和肿瘤异质性11。这种方法的效用也说明了弥漫性大 b 细胞淋巴瘤 (dlbcl), 其中 b 细胞受体同时 c-myc 和 bcl-2 表达的信号增加表明布鲁顿酪氨酸激酶抑制的潜在治疗应用12.
在这里, 我们描述了整个协议, 从抗体验证, 选择适当的控制组织和多路复用使用淋巴瘤 ffpe 组织, 最终分析染色幻灯片使用扫描自动定量病理成像系统。
Protocol
Representative Results
Discussion
mf-ihc 有可能使病理学家能够改进淋巴病理诊断标准, 并分析生物标志物在特定细胞类型中的作用, 以预测临床结果。mf-ihc 作为一种新的研究方法, 越来越多地应用于肿瘤细胞17的多重免疫参数的定量和空间识别。mf-ihc 检测肿瘤生物标志物的共表达已被证明是可重现和可靠的5。然而, 这项技术仍然是新生的, 并受到由于反应和组织相关因素而产生的变异性, 例如由?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
s. b. n. 和 a. d. j. 得到新加坡卫生部国家医学研究委员会过渡奖 (nmrc/2013 和 nmrc 00.塔/00 2016) 的支持。作者承认新加坡国立大学癌症研究所向 a. d. j. 提供的用于购买 vectra 光谱成像显微镜的永秀 yoon 研究赠款。这项研究获得新加坡 nhg 领域特定审查委员会 b (2014/00693) 的批准。
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
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